籼稻KraDangNgah成熟胚愈伤组织诱导及植株再生研究.docVIP

籼稻KraDangNgah成熟胚愈伤组织诱导及植株再生研究 　　摘要：为了建立籼稻KraDangNgah的再生体系，以其成熟胚作为试验材料，研究不同种类植物激素及其浓度配比对诱导愈伤率、愈伤组织形态学特征、分化及植株再生的影响。结果表明：2，4-D可诱导愈伤组织产生，但愈伤组织诱导率极低；2，4-D和其他植物激素配合使用显著提高了诱导率，在2mg/L2，4-D、1mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN的条件下可获得较高的愈伤组织诱导率，为56.3%。继代培养基中添加激素浓度为诱导培养基中的一半可获得较好的增生的胚性愈伤组织，形态学特征为淡黄色，比较致密、较硬、呈颗粒状结构，没有褐化出现，表现出很强的分化能力。再生培养中，MS培养基中添加0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN可获得较高的分化率（达到75.5%）和再生率（33.3%），表明6-BA和Kn的配合使用显著提高了分化率。 　　关键词：籼稻；成熟胚；愈伤组织；再生植株 　　中图分类号：S511.2+10.43文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0045-03 　　利用转基因技术进行遗传改良是改善籼稻品质、提高抵抗病虫害能力、培育新品种的重要手段之一，而高效的再生体系是遗传转化成功的先决条件。近年来，研究者从幼穗、幼胚、花药等部位诱导出愈伤组织和再生植株，愈伤组织诱导率高、质量好，被广泛用于水稻的遗传转化、品种培育中[1]。但是，上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展。从胚性愈伤中首先获得再生植株的是在粳稻中[2]，在籼稻中由于受到许多因素的限制，比如品种具有倔强的对抗外来刺激的特性[3]和具有基因型专一性[4-5]，使从成熟胚中诱导胚性愈伤组织率和植株再生率很低，导致了籼稻遗传转化很困难。 　　籼稻KraDangNgah是泰国南部的当地品种，因营养价值很高且具有特殊香味而深受人们喜欢，但容易遭受病虫害的危害。到目前为止没有关于籼稻KraDangNgah再生体系的研究报道。本研究为了建立KraDangNgah再生体系，为遗传转化打好基础，以成熟胚作为试验材料，对其在不同激素及浓度配比条件下的出愈率、愈伤组织状态及再生率进行研究，以期获得状态较好的愈伤组织，建立高效的再生体系。 　　1材料与方法 　???1.1试验材料及种子灭菌 　　籼稻KraDangNgah（OryzasativaL.）种子由泰国宋卡王子大学自然资源学院提供。健康成熟的种子剥去外壳后浸入70%乙醇中1min进行表面消毒，然后放入20%次氯酸钠溶液中，滴入2～3滴Tween205min；最后在超净工作台中用无菌蒸馏水洗4～5次；再将种子放在无菌滤纸上吸干水分，备用。 　　1.2试验方法 　　1.2.1愈伤组织的诱导 　　灭菌的种子接种到愈伤组织诱导培养基上，即MS培养基+3%蔗糖+0.75%琼脂糖+1～4mg/L2，4-D，pH值调节到5.7。愈伤组织诱导在25～27℃、16h光照条件下培养30d后，调查诱导率及愈伤组织的状态，愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的种子数/接种的种子数×100%。然后将愈伤组织转接到继代培养基继代培养。 　　1.2.2愈伤组织诱导率的提高及优化 　　为了提高愈伤组织诱导率和质量，将灭菌种子接种到经“1.2.1”节试验筛选出的较好的愈伤组织诱导培养基中，同时加入其他激素[（1）1mg/L2，4-D+1.5mg/LTDZ；（2）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA；（3）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（4）2mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（5）4mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（6）4mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN]和1g/L水解酪蛋白（CH），愈伤组织诱导的培养条件如“1.2.1”节所述。经过30d培养后调查愈伤组织的大小、形态和诱导率，然后转接到继代培养基中。 　　1.2.3愈伤组织的继代培养 　　为了选取质量好的胚性愈伤组织，将从成熟胚中诱导出的愈伤组织转接到添加激素及浓度配比与愈伤组织诱导培养基相同或减半的MS培养基中，所有继代培养基中添加1g/LCH。培养30d后记录胚性愈伤组织的诱导率和褐化率，并在立体显微镜下鉴别胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，然后转接到再生培养基中。 　　1.2.4植株再生培养 　　选取好的胚性愈伤组织，转接到添加不同细胞分裂素及浓度配比的MS培养基中，30d后调查再生情况。 　　1.3数据统