脊髓和背根神经节免疫组化制片实践和体会.docVIP

脊髓和背根神经节免疫组化制片实践和体会 　　免疫组织化学ABC法是一种古老而经典的染色技术，由于敏感性高，操作时间短而被广泛使用，也是研究生最常用的实验方法之一[1]。免疫组化制片过程包括灌注、取材、切片和染色四个部分，任何一个环节的失误都会影响到最终片子的质量，从而影响实验结果的展示。作者在研究生期间采用ABC法进行了大量大鼠脊髓和背根神经节（DRG）冰冻切片的免疫组化染色实验，通过重视操作的每一个环节，改良优化一些细节，使制作出的脊髓片和DRG片质量大为提高，实验结果更为精准、美观。以下是在实验中总结出的一些心得体会。 　　1灌注的好坏直接影响了固定的质量。 　　灌注是免疫组化实验的第一步，主要包括两个环节：灌注液的配制和灌注时的操作。 　　在我们实验中通常配制含4%多聚甲醛的PB缓冲液作为灌注液，一般都能有较好的固定效果。但如果发现灌注后大鼠四肢不硬或取材脊髓太软时，可通过在灌注液中添加50~75%的饱和苦味酸，增加灌注液的组织穿透性和增强组织韧性来解决。我们早期实验中曾使用过一只十分难染的抗体TRPV4，在DRG中染色很多次都没有阳性结果。一次降低灌注液的浓度至2%后，可见有明显的阳性染色出现，因此适当降低灌注液的甲醛浓度，是一种针对难染抗原的方法之一。 　　做好准备工作后就可以进行灌注了，此过程并不复杂，但如果操作不慎，也会导致灌注失败，浪费辛苦所得的模型动物。在我们实验中会注意以下一些细节，通常都能取得较高质量的固定效果。①灌注前务必要彻底排尽管子内的空气和气泡，这样做主要是为了防止空气栓塞于小血管，影响灌流液与组织的充分接触。②在暴露心脏和升主动脉根部时不仅速度要快，而且视野要充分，尽量在心脏停跳后不久即完成灌注，促进灌注液的流动。另外，穿刺时可先在心尖处剪一小口，这样不仅能减少穿刺时的阻力，防止组织堵塞针头，也可降低因血容量急剧增多引起末梢微血管破裂。同时应注意穿刺时，针头尖端进入升主动脉内1~2 mm即可（大鼠），不宜过长，以免因针头顶住血管壁而增加灌流阻力；也不宜过短，否则部分灌注液可能会从心脏剪开的部位漏掉。③当灌注液进入体内后，大鼠出现四肢明显抽搐，肝脏发白，以及内脏鼓起即表明灌注成功。如果初次灌注或操作不熟练造成组织固定效果不好时，可将组织置于灌注时的同一灌注液中4~6 h，进行后固定以增加固定效果，但后固定的时间不要超过24 h，否则会形成结晶，影响染色结果。 　　2取材时组织的完整性对于标本的美观十分重要。 　　脊髓取材相对较为简单，注意操作时器械尖端紧贴椎骨一点点掀开骨片，避免划伤组织即可。但是DRG由于位于椎间孔内，标本小且位置深，直接去椎骨取材常易损伤DRG组织。因此，我们采用沿坐骨神经逆行追踪L4和L5神经至椎间孔，再沿神经走行方向用力将DRG从椎间孔拉出的方式进行取材，这样既能保证DRG结构的完整性，在熟练掌握的基础上也相对简单易行。而且即使神经被拉断，仍可通过掀开椎骨的方式取出DRG。需注意的是：如同时需要脊髓组织时，务必先取脊髓后拉DRG，否则会因牵拉对脊髓组织造成一定的损伤。 　　取材后的脊髓或DRG需在30%的蔗糖溶液中放置至组织沉底，目的是将组织中的水分充分置换出，以减少在冰冻时形成冰晶损伤组织。但蔗糖溶液易生霉菌，若要较长时间保存组织则必须在溶液中加入0.03%的叠氮钠，否则会使组织发生霉变而无法使用。 　　3切片的质量是染色的前提。 　　神经组织多采用冰冻切片。由于在组织冻结过程中，细胞内、外的水分都会形成冰晶，且冻结速度越慢，形成的冰晶越大，对组织和细胞形态结构的损害也就越严重。因此我们会在冻结前将组织浸埋于OCT包埋剂中，再速冻到-20℃，以达到尽量减少冰晶形成，且支撑组织的目的。在此过程中，包埋剂的使用既不能过多也不能太少，太少不能起到对组织的支撑作用，使切片时组织容易出现皱褶或碎裂，但太多也会增加切片后的漂洗过程，更为重要的是由于包埋剂和组织的硬度不同，容易在切片过程中带离部分或全部组织，造成切片失败。 　　脊髓的实验常采用连续冠状切片，而DRG因组织小，为了得到最大组织截面通常采用矢状切片，且将片厚减小到10 μm以增加切片数量。但是由于切片薄，面积小且纤维较多，如果像脊髓片那样进行漂片染色，则可能会因漂洗过程反复挑起组织而造成损伤，而且染色结束后很难保证DRG片的平整，影响镜下观察。因此在我们的实验中DRG片均是在切片后即贴片。不仅如此，我们还进行连续贴片，通常一个大鼠的DRG可以连续贴出6张载玻片，每张玻片上4~5个DRG片，这样做目的是为了得到6套结构基本相似的DRG玻片，有利于进行相似结构不同抗体的对比实验。然而，贴片染色最大的问题就在于反复漂洗等过程中容易脱片，因此对载玻片的前期处理就显得格外重要。我们实验中对新购的载玻片依次要经