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致孔剂溶解度参数对大孔层析介质结构影响研究 　　摘 要 分别以甲基丙烯酸缩水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯为功能单体和交联剂，采用悬浮聚合方法制备了大孔聚合物微球。考察了致孔剂的组成及用量对微球的孔径、比表面积的影响，其中随着致孔剂中的良溶剂（二氯甲烷 δ=9.7 （cal/cm3）1/2）和不良溶剂（正辛醇δ=10.3 （cal/cm3）1/2的比例变化，致孔剂体系溶解度参数可调范围为9.89～10.09 （cal/cm3）1/2），随着致孔剂与聚合物之间溶解度差值的增加，微球的孔径随之增大而比表面积呈下降趋势。将此类微球偶联聚乙烯亚胺衍生为阴离子交换层析介质，以前沿分析法比较了不同孔径的微球的传质性能，其中孔径为257 nm的介质仍能保持较高的动态蛋白载量（45.1 mg/mL），表明此类大孔介质在高通量分离纯化应用方面具有很大潜力。 　　关键词 致孔剂； 溶解度参数； 大孔微球； 蛋白质； 分离 　　1 引 言 　　人们对生物制品的需求日益增加，促使生物制药生产规模不断增加，如何高效地获得符合要求的生物产品，是下游分离纯化技术所面对的挑战，因此发展高通量的分离分析方法势在必行。层析分离作为一种主流技术在蛋白分离纯化中占有重要地位，其中色谱层析介质是分离柱的核心。当前以琼脂糖为基质的介质应用广泛，具有生物相容性好、化学稳定性高等优点，但其缺乏机械刚性、耐压性差（通常100 nm），更适合大尺寸分子的传质，能够满足快速、高通量分离纯化的需求，可弥补这些不足[2]。 　　以琼脂糖为基质的介质多以悬浮自由基聚合制备而成，控制微球结构从而获得贯通孔是制备难点。二十世纪九十年代初出现的颗粒内以对流传质为特征的灌注色谱填料（POROS 系列）[3]，其最大特点为同时具有贯通孔（500～800 nm）和扩散孔（20～100 nm），在保证蛋白分子快速传质的同时具有较高的蛋白载量。这种介质制备过程中先形成纳米粒子，然后粒子间进行团聚从而得到大孔微球，因其制孔过程复杂而难以准确控制[4]。Sun研究组[5，6]采用碳酸钙颗粒和有机溶剂作为致孔剂制备超大孔PGMA微球，得到具有102 nm孔径微球，但由于无机颗粒与有机聚合物的相容性较差，所得微球的贯通孔不易均匀控制； Zhou等[7，8]研究了以反胶团溶胀法制备聚丙烯酸酯类和苯乙烯类为基质的超大孔层析介质。以上两种方法均是通过设计不同的致孔剂，从而制得贯通孔结构。该类大孔聚合物微球对蛋白大分子有着较好的传质性能，但同时其比表面积会显著降低，甚至低于10 m2/g，介质的蛋白载量难以提升[9，10]。本课题组前期工作中采用原子转移自由基聚合方式制备大孔聚丙烯酸酯类微球，具有200～300 nm的贯通孔[11，12]，同时具有较高的比表面积，在调控孔径及比表面积的过程中发现，致孔剂对于微球结构的影响最为显著，但对其影响规律未做进一步研究。 　　本研究仍分别以甲基丙烯酸缩水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯为功能单体和交联剂，在传统悬浮聚合体系中，系统研究了致孔剂组成及用量对微球的结构包括孔径大小、比表面积、表面形貌、蛋白载量等的影响，探索了溶解度参数与微球结构之间的规律关系。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　FEI Quanta400F扫描?子显微镜（美国FEI公司）； Autopore IV9500压汞仪（美国Micromeritics公司），VSorb 2800比表面积测定仪（南京金埃谱公司）； KTA Purifier 10 蛋白层析系统（美国GE公司）。 　　甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，纯度98%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，纯度98%）、聚乙烯醇（PVA，醇解度87%，平均聚合度1700）、聚乙烯亚胺（PEI分子量600）均为试剂纯（阿拉丁试剂公司）； 偶氮二异丁腈（AIBN，分析纯）、二氯甲烷（DCM，分析纯）、正辛醇（OA，分析纯）、十二烷基苯磺酸钠（SDS，纯度99%），国药集团； 牛血清白蛋白（BSA，试剂级，纯度98%，美国SigmaAldrich公司）。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 大孔聚合物微球的制备 介质采用悬浮聚合方法制备，其反应过程如图1所示，具体实验步骤如下：（1）配制水相：称取10 g PVA、1.0 g SDS加入1000 mL去离子水中，水浴加热至80℃，在磁力搅拌下至完全溶解成透明溶液，冷却至室温，备用； （2）配制油相：称取0.040 g AIBN加入25 mL三角瓶中，然后再依次加入1.0 mL GMA、1.0 mL EDMA、1.5 mL二氯甲烷、1.5 mL正辛醇，在室温下振荡15 min混合均匀； （3）在通入氮气的条件下，将油相缓慢滴入水相中， 200 r/min搅拌，滴加完毕后，升温至60