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蝉花真菌分离及液体发酵培养基优化 　　摘要： 通过蝉花僵虫体、子座芽、孢子3个部分的分离培养，利用单因素和正交试验，优化生产虫草酸各营养因子的最佳种类和配比，以达到蝉花真菌的分离及液体发酵培养基的优化效果。结果表明，分离得到的蝉花真菌为拟青霉属蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae （Miquel.） Samson]；工艺优化后得出蝉花液体发酵最佳培养基配方为蔗糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4?7H2O 0.5 g/L；生物量和虫草酸总产量能分别提高1.852 g/L、17.774 mg/g。 　　关键词： 蝉花真菌；分离培养；液体发酵；工艺优化；培养基优化 　　中图分类号： S567.3+90.43 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）22-0153-03 　　蝉花（Cordyceps cicadae）别称蝉虫草、蝉茸、胡蝉等，主要产于江浙一带丘陵竹林中，云南和四川等地也有分布。蝉花药性甘寒、无毒，《本草纲目》记载“蝉花可治疗惊痫，夜啼心悸，功同蝉蜕”。蝉花中含有丰富的氨基酸、蛋白质、真菌多糖等生理活性物质，具有镇痛退热、镇静明目、降低血压、抗疲劳、抗肿瘤及提高免疫力的功效[1]。蝉花一般生长在针阔混交林带，山峦平缓起伏，生态环境优良，分布满山遍野的毛竹林，阴蔽较好的林地都有金蝉花，尤其在向阳坡地的竹林下，落叶和腐殖层很厚，透气、透水、保温，密布粗壮、浓白的菌丝体[2-4]。 　　由于野生蝉花生长环境被破坏及滥采现象严重，导致当前野生蝉花资源日益减少，另外人工采集野生蝉花劳动强度大，其作为中药材走向国际市场存在功能活性组分不明、原料不纯等问题[5-6]。本研究通过用蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae （Miquel.） Samson]的分离培养，优化液体发酵工艺来生产菌丝体，旨在解决以上资源短缺及产品品质等问题。 　　1 材料与方法 　　1.1 蝉花来源 　　蝉花标本采集于江苏省句容市磨盘山海拔高度200～400 m的竹林中，冰袋低温保存新鲜金蝉花，24 h内处理。 　　1.2 试剂与仪器 　　1.2.1 试剂 　　甘露醇标准品、Nash（乙酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮）、高碘酸钠、L-鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、麸皮、蛋白胨、酵母膏、豆粉、酪蛋白、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4?7H2O、KCl、CaCl2。 　　1.2.3 仪器 　　水浴恒温振荡器（SHZ-28A，江苏省太仓市华美生化仪器厂）；电子天平（KF6102，浙江凯丰集团有限公司）；千分之一精密电子天平（JA5003N，上海精密科学仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；数显恒温水浴锅（HH-4，江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司）；可见分光光度计（WFJ-7200，上海尤尼柯仪器有限公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 培养基 　　1.3.1.1 分离培养基 　　土豆15.00%，葡萄糖2.00%，蛋白胨0.20%，KH2PO4 0.10%，MgSO4?7H2O 0.05%，琼脂粉 1.50%；pH值自然，121 ℃灭菌30 min。 　　1.3.1.2 母种培养基 　　土豆20.00%，葡萄糖2.00%，蛋白胨0.15%，KH2PO4 0.10%，MgSO4?7H2O 0.05%，琼脂粉 1.50%～2.00%；pH值自然，121 ℃灭菌30 min。 　　1.3.1.3 液体菌种培养基 　　土豆20.00%，蔗糖5.00%，豆粉0.50%，KH2PO4 0.50%，MgSO4?7H2O 0.05%；pH值自然，121 ℃灭菌30 min。 　　1.3.2 蝉花真菌的分离培养 　　1.3.2.1 僵虫体分离 　　无菌水浸泡虫体10 min搅拌出泥沙，0.1%氯化汞溶液浸泡2～3 min，75%乙醇棉球擦拭，无菌水漂洗3次；取虫体前段，切开外壳，取血腔菌丝3～4 mm，接入分离培养基[2]；于28 ℃培养48 h，分离培养去杂菌，移入试管斜面培养并低温保存。 　　1.3.2.2 子座芽分离 　　取子座芽，无菌水洗净，0.1%氯化汞溶液浸泡2～3 min，无菌水洗净，取中间3～4 mm组织块接入培养基，置于28 ℃培养48 h，挑取少量菌丝分离培养去杂菌，移入试管斜面培养并低温保存。 　　1.3.2.3 孢子分离 　　取无菌纸袋套住蝉花（花蕾），反复振荡，使孢子黏附到袋壁上，将纸浸入25%葡萄糖液中，洗孢子，混匀。取0.1 mL原液，加入1.0 mL无菌水，1.0 mL 01% NaOH，2～3 min后加入无菌水，离心洗涤3次，加入25%葡萄糖溶液，28 ℃培养。