蝙蝠葛酚性碱调控Glil基因抗胰腺癌机制研究.docVIP

蝙蝠葛酚性碱调控Glil基因抗胰腺癌机制研究 　　关键词：蝙蝠葛酚性碱；Glil；胰腺癌中图分类号：R285.5 　　文献标志码：A 　　文章编号：1007 - 2349（ 2015） 03 - 0064 - 02 　　PAMD为多种脂溶性生物碱的混合物，是从中药北豆根（防己科植物蝙蝠葛根茎）中所提取。为了证实PAMD抗胰腺癌的相关作用机理是否与通过抑制Hedgehog信号通路的激活所发挥的作用有关，本实验主要采用了RT - PCR检测PAMD对人胰腺癌细胞株BxPC -3裸鼠移植瘤Hedgehog信号通路中关键分子GlilmRNA表达的影响，探讨PAMD的抗肿瘤作用以及Hedgehog信号通路在胰腺癌中的作用机制，为临床上抗肿瘤新药的研发提供了新的方向和思路。1 实验材料 　　PAMD购自于黑龙江中医药大学药学院；5-氟尿嘧啶（5 - Fu）购自sigma公司；人源性胰腺癌BxPC -3细胞株购自中国科学院（上海生命科学院细胞资源中心）；实验动物购自上海斯莱克动物实验有限公司；胰蛋白酶（GIBCO分装伯安生命技术有限公司）；DU800核酸蛋白分析仪购自Beckman公司；SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自TaKaRa公司：Prime -Script RT试剂盒购自TaKaRa公司；ABI 7500实时荧光PCR仪购自Applied Biosystems公司。2实验方法2.1 动物分组50只裸鼠，雌性，（4 -6）W龄。造模24 h后，随机将其分成5组，分别为模型对照组、空白组、5 - FU组、PAMD低剂量组、PAMD高剂量组，每组10只。2.2给药途径及剂量实验分组和给药剂量：模型组及空白组：每天给予同等容积的生理盐水（0. 9% NaCl），但空白组不需要接种瘤株；5 - FU组：按20 mg/kg腹腔注射给药PAMD；低剂量组：按10 mg/kg腹腔注射给药；PAMD高剂量组：按20 mg/kg腹腔注射给药。各实验用药治疗组均连续给药21 d。2.3造模及取材取冻存胰腺癌细胞株BXPC -3，投入37℃水中，1min内融化，离心去除冻存液，用约10倍冷RPMI1640完全培养液洗1次，接种于培养瓶中，置于37C、饱和湿度、5% C02培养箱中，隔日换液，细胞长成单层后，用0.25%胰酶、EDTA消化、传代，并以倒置显微镜监控。待细胞进入对数生长期后，收集细胞并用RPMI1640调整浓度为5×l06个?mL-1的细胞悬液，接种于40只裸鼠右腋窝皮下，每只鼠0.2 mL。21天后处死动物，取瘤组织1.0g，Trizol法进行提取总RNA，Trizol法提取总RNA，总RNA反转录为cDNA，相对定量数据处理（2-△△CT法）。引物由上海生工生物工程公司合成。2.4统计学方法数据经检测均符合正态分布和方差齐分析，并用统计学软件SPSS 19.0数据处理分析，所得实验数据以均数±标准差表示，而多组间的差异性比较主要采用单因素的方差分析（ one way ANOVA）。3实验结果3.1 p - action扩增曲线及溶解曲线 B- action mRNAReal - time PCR扩增曲线及Ct值见图1，溶解曲线见图2。3.2 Glil mRNA Real - time PCR扩增曲线及溶解曲线 GlilmRNA Real - time PCR扩增曲线及Ct值见图3，溶解曲线见图4。3.3 　　PA MD对Glil mRNA表达影响 PAMD对Glil mRNA表达的影响见表l。 　　从表l结果表明，PAMD治疗组Glil mRNA的表达与模型对照组比较，差异显著具有统计学意义（P0.01）。4讨论 　　研究显示，Hedgehog信号通路的调节失衡或异常激活与胰腺癌的产生以及其恶性的生物学特性是密切相关的，但在正常的胰腺组织中却不表达或仅有轻度的表达[1]。本实验结果表明Gli - 1蛋白在模型组中呈高表达、强阳性。而PAMD治疗组与模型对照组比较表达水平均有所降低，有差异性具有统计学意义（P0.01）。结果提示：在胰腺癌的肿瘤组织中Hedgehog信号通路的活性被重新激活，其主要成员表达异常增高，这与其他恶性肿瘤中该通路的表达情况是一致的[2-4].同时说明PAMD具有抑制此信号通路主要蛋白表达的功能，从而起到抗肿瘤的作用。参考文献：[1] Kayed H，Kleeff J，Esposito I，et al.Localization of the human hedgehog-interacting protein（ Hip） in the normal and diseased pancreas[J].Mol Carcinog，2005 ，42 （4）：183-192.[2] Oro A E，