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藏猪粪便芽孢杆菌基因组DNA提取方法 　　摘要：藏猪源的芽孢杆菌制剂具有潜在研究应用价值，更好地提取其基因组DNA对后期研究具有重要作用。采用微波法、酚/三氯甲烷法、改进CTAB法、试剂盒法等4种方法提取同一份藏猪粪便DNA，测定所得DNA含量及纯度，然后对DNA进行16S rRNA基因扩增并使用琼脂糖凝胶电泳法对比。结果表明，4种方法均能提取到藏猪粪便的芽孢杆菌基因组DNA，微波法虽然得到最多的DNA，但是其蛋白质含量过高，DNA纯度最低；试剂盒法提取的DNA纯度最高，但是DNA含量太低；综合比较，改进CTAB法DNA得率多且纯度高，性质稳定，扩增效果好，价格低廉，是最优提取方法。 　　关键词：藏猪；粪便；基因组DNA；提取方法 　　中图分类号： S852.6 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0093-02 　　藏猪别称藏香猪，原产于中国青藏高原海拔2 500～4 300 m 的农区和半农区。藏猪保存了较为纯正的品系资源，是唯一能适应高原海拔气候和以放牧为主的猪种，是我国特有世界珍稀的草食性优良品种[1]。藏猪肉质优良，主要源于其食草特性和生活环境，也与其不同于其他猪种的特殊胃肠道环境有着密不可分的关系。芽孢杆菌制剂通常都是以休眠孢子的形式存在，进入动物肠道后，孢子能在肠道上部迅速萌发、增殖，并分泌很多种活性很强的消化酶，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，同时可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，增强肠道对厌氧益生菌的定植，抑制致病菌生长，平衡、稳定乳酸杆菌，维持肠道微生态平衡[2-5]。 　　藏猪来源的芽孢杆菌制剂具有潜在的开发研究价值，提取其基因组DNA在开发研究中具有重要的意义，理想的基因组DNA获取方法除了考虑到DNA的产率，还要考虑到尽可能减少DNA的降解及试剂成本等。目前，已经有多种提取微生物基因组DNA的方法[6-8]，如微波法、酚/三氯甲烷法、CTAB法、试剂盒法等。为了探究不同方法获取的基因组DNA对芽孢杆菌研究的影响，本试验采用4种方法对样品进行基因组DNA的提取，通过紫外可见分光光度计、琼脂糖凝胶电泳分析不同方法得到DNA的产量、纯度、稳定性，再将获得的基因组DNA进行16S rRNA基因扩增进行对比并评价。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要试剂 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）裂解液、酚、三氯甲烷、异戊醇、无水冰乙醇、AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒、琼脂糖、磷酸钠缓冲液（pH值7.0）、10%SDS溶液、TAE缓冲液、TE缓冲液、LB液体培养基等。 　　1.1.2 试验样品 采集于西藏林芝地区一牧民家中公藏猪新鲜粪便，-80 ℃液氮保存带回实验室。 　　1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪，东胜龙ETC811；高速冷冻离心机，Thermo；紫外可见分光光度计，上海成光仪器有限公司；凝胶成像系统，Tanon；电泳仪，Tanon；电泳槽，Tanon；微量移液器，Eppendorf；电子天平，江苏省常州市宏衡电子仪器厂；涡旋振荡器，北京优晟联合科技有限公司等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 样品预处理 称取冻存的粪便样品5 g于4 ℃冰水或冰盒上解冻，置于50 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，并充分涡旋混匀，纱布过滤后，收集滤液并于沸水浴中处理 5 min，吸取1 mL热处理后的滤液加入到19 mL LB液体培养基中，振荡培养24 h，4 ℃保存备用。 　　1.2.2 基因组DNA的提取 　　1.2.2.1微波法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心2 min，再用PBS洗涤菌体2～3次；（2）弃上清，加500 μL 1×TE吹打混匀，取100 μL于200 μL EP管，12 000 r/min离心2 min；（3）弃上清，加100 μL 1×TE吹打混匀，12 000 r/min离心2 min；（4）弃上清，加100 μL 1×TE吹打混匀，用微波炉（先预热1 min）加热1 min，12 000 r/min 离心2 min；（5）收集上清液，即为所提DNA。 　　1.2.2.2 酚/三氯甲烷法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于 1.5 mL EP管中，10 000 r/min离心3 min，弃上清；（2）加入 500 μL STE液悬浮，加10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，37 ℃ 恒温水浴20 min，再加入10% SDS 20 μL，10 mg/mL PKA 20 μL；（3）置于55～65 ℃恒温水浴中1～3 h；（4）500 μL 酚-三氯甲烷-异丙醇（体积比为25 ∶24 ∶1），下层生成