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蘑菇圈上四孢蘑菇个体间遗传差异ISSR分析 　　摘要:对四孢蘑菇(Agaricus campestris L.:Fr.)形成的蘑菇圈形态和子实体发生进行了调查,并对蘑菇圈上的四孢蘑菇个体间遗传差异进行了ISSR分析,建立遗传关系聚类图。结果表明,在生长于四川西部平坦高原草地上,四孢蘑菇形成的蘑菇圈为圆环状,蘑菇圈上生长的植物明显较蘑菇圈内、外生长的植物茂盛,同一蘑菇圈上生长的子实体生长期不完全一致;同一蘑菇圈上的四孢蘑菇个体之间相似系数为0.473～0.755,不同蘑菇圈上的个体遗传相似系数为0.333～0.604;在相似系数0.524水平上,不同蘑菇圈上的四孢蘑菇个体分别聚为不同类群。 　　关键词:四孢蘑菇;蘑菇圈;子实体;遗传差异;ISSR 　　 　　蘑菇圈是常见的生态学景观[1],SHANTZ 和PIEMEISEL依据蘑菇圈对植物的影响将其划分成3个类型:一类为对植物生长具有破坏作用, 蘑菇圈具有圈内绿草环、枯草环和圈外绿草环;第二类为对植物生长具有促进作用, 该类型蘑菇圈中只有一个绿草环带;第三类为对植物生长没有影响[2]。KOBAYSHI和YOKOI发现蘑菇圈中子实体个体间距离近的遗传关系较近,遗传型与空间分布一致, 与周围植物的构成无关联[3]。 　　 　　四孢蘑菇(Agaricus campestris L.:Fr.)在我国各省区均有分布[4],在草地上往往形成蘑菇圈。为探讨蘑菇圈上的四孢蘑菇子实体是否为同一个菌株的后代,以及在多年的生长过程中是否发生了变异,本试验利用ISSR(inter simple sequence repeat)分子标记对生长在相同和不同蘑菇圈上的12个子实体进行遗传差异分析,为科学利用四孢蘑菇种质资源提供依据。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1.1供试材料 　　 　　供试材料Agk11、Agk21、Agk41、Agk51、Agk61、Agk71、Agk81、Agk111和Agk131分别为从同一蘑菇圈的不同子实体上经组织分离获得的菌株,AgI101、AgA12和AgS641为分别从生长在其它3个蘑菇圈上的3个子实体上经组织分离获得的菌株,均保藏在四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物研究室。子实体均采自四川若尔盖县。 　　1.2培养基 　　组织分离培养基:加富PDA(马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨2 g,琼脂20 g,水1 000 mL)。 　　液体培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨2 g,水1 000 mL。 　　1.3菌丝体培养 　　250 mL三角瓶装液体培养基50 mL,接3块直径为0.5 cm的菌块,25 ℃恒温培养箱内黑暗静置培养20 d。 　　1.4DNA提取 　　菌丝体DNA提取采用CTAB法[5]。 　　 　　1.5供试引物 　　根据British Columbia 大学公布的ISSR引物序列,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成60条引物,从中筛选出扩增条带较多、信号较强且背景清晰的8条引物用于ISSR-PCR反应(表1)。 　　1.6ISSR扩增反应 　　本试验Taq DNA聚合酶、dNTP购自美国MBI Fermentas公司。反应体系的总体积为25 μL:2×PCR Master Mix 15 μL,ISSR引物(0.2 μmol/μL)2 μL;模板DNA 1.5 μL,加ddH2O补齐25 μL。在Bio-rad My Cycler型PCR仪(美国)上扩增反应。扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 45～59 ℃(根据引物G-C含量而定)复性45 s,72 ℃延伸1.5 min,共35个循环;最后72 ℃补平7 min;4 ℃终止反应。将ISSR-PCR产物与3 μL溴酚蓝指示剂混合,在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用Goldview 染色,在BIO-RAD UNIVERSAL HOOD Ⅱ型凝胶成像仪(美国)上扫描记录结果。 　　1.7电泳检测与数据分析 　　将琼脂糖凝胶上出现DNA片段的记为“1”,相对应不出现的记为“0”,用NTSY Spc2.1软件计算遗传相似系数,以类平均连锁法(UPGMA)进行聚类分析,建立聚类树状图。 　　 　　2 结果与分析 　　 　　2.1蘑菇圈形态与子实体分布 　　在四川西部高原草地上,常见由四孢蘑菇生长形成的蘑菇圈,直径0.5～12 m,在生长子实体部位的草本植物明显比其它部位茂盛,颜色也较深,蘑菇圈内、外植物长势一致(图1-A),蘑菇圈上四孢蘑菇子实体呈圆环状分布,在同一时期四孢蘑菇个数在7～58之间,有的已成熟,有的还是幼菇,生长期不完全一致(图1-B)。 　　2.2ISSR扩增 　　2.2.1ISSR