迷走神经对大鼠肝细胞中NTCP表达作用研究.docVIP

迷走神经对大鼠肝细胞中NTCP表达作用研究 　　摘要：目的本实验拟通过建立去迷走神经肝支大鼠模型，探讨迷走神经对肝细胞功能、状态及NTCP的表达变化的影响。方法大鼠随机分为两组：A组：迷走神经肝支切断组， B组：假手术组，每组20只。通过HE染色法光学显微镜下观察切断迷走神经肝支后的肝脏病理形态学改变，分别通过RT-PCR及Western blotting法检测NTCP的表达变化，来分析迷走神经对其影响。结果去迷走神经组中，肝脏组织NTCP mRNA和NTCP基因表达均随着术后时间其表达明显下降。结论在去迷走神经肝支状态下，肝细胞发生改变，NTCP表达水平减少，进而影响胆盐因子转运及表达。 　　关键词：NTCP ；迷走神经；RT-PCR；Western blotting支配肝脏的神经分布广泛，肝实质细胞如肝细胞和非实质细胞如Kupffer细胞、肝窦内皮细胞等都被交感神经和副交感神经双重支配着[1]。国内外的研究表明，支配肝脏的神经在调节肝脏血流的改变，物质代谢以及胆道系统的功能方面均有重要作用。Na+牛磺胆酸盐同向转运多肽（NTCP）是肝细胞特有的一种转运载体，在肝小叶和肝的腺泡均有广泛分布，胆汁酸盐4/5的结合型牛磺胆酸被钠离子依赖性途径所吸收，最终形成了胆盐依赖性胆汁流，被称为重要的胆盐摄取系统[2]。 　　1实验方法 　　1.1实验动物与分组 健康Wistar大鼠40只，雌性，清洁级动物，体重200~220 g(佳木斯大学动物实验中心提供)。大鼠饲养于恒温清洁环境，喂饲标准饲料，维持12 h昼夜节律。随机分为以下二组：A组：迷走神经肝支切断组，B组：假手术组，每组20只。A组距离贲门0.5 cm分出的迷走神经肝支并离断；假手术组大鼠开腹后探查迷走神经(见照片1)。各组分别在手术后第1，3，5，7，9 d剪取肝组织。分别进行HE染色，观察肝脏病理形态学的变化。 　　1.2通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测NTCP mRNA 的表达变化 用Trizol液提取组织mRNA，分光光度法测定RNA的纯度，采用RT-PCR技术，以β-actin为内参，引物序列sense 5-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCA 　　GC-3,Antisense 5-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3扩增产物片断大小为121bp；β-actinsense5-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3,Antisense 5-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3?扩增产物片断大小为241 bp。退火温度分别为56℃、54.7℃。用凝胶成像系统照像，Bandscan软件进行图像分析，结果以目的区带的光密度值积分/ 内参区带的光密度值积分表示,作为目的mRNA 的相对含量,进行半定量分析。 　　1.3 Western blotting法检测NTCP蛋白水平 模型制作成功后，取材大鼠肝组织并进行总蛋白的提取，利用Pirece公司提供的组织蛋白抽提试剂盒来完成对肝组织的提取，Bradford法测定蛋白浓度后，电泳、转膜、经一抗、二抗后，通过化学发光法来进行底物显影，然后用图像分析仪来检测X片效果，用Image Pro Plus软件进行相应蛋白条带的半定量分析。 　　1.4统计学分析 统计分析的进行需要应用SPSS 18.0软件，实验结果均以均数±标准差（x±s）表示，经双因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01判定差异就有显著性，P0.05，无统计学意义。 　　2结果 　　2.1一般情况 大鼠在手术后10~15 min，清醒，站立，3 h后开始进食水。A组（n=20）术后皮毛杂乱失去光泽，活动减少，食欲不振，体重下降，尿量减少、颜色变深，大便颜色变浅。B组（n=20）术后皮毛颜色正常，行动如常，食量以及二便如常。 　　A组术后9d存活率为80%（16/20），病死的4只中麻醉意外1只，感染死亡1只，全身衰竭2只；B组术后9 d存活率为90%（18/20），病死的2只中，感染死亡1只，出血死亡1只。A组死亡率与B组相比，差异具有统计学意义。（P＜0.05） 　　2.2去迷走神经肝支术后肝脏病理形态学改变 通过本实验大体观察，A组术后肝脏外观轮廓稍有肿大，表面呈黄褐色，失去光华红润的外表，部分可见黄色结节。B组大鼠肝脏轮廓正常，表面呈红褐色，。HE染色显示A组大鼠肝小叶结构尚完整，肝细胞肿胀，位于中央静脉周围的肝细胞无折光性，棕褐色胆汁色素颗粒沉积，在术后第7、9 d可见，肝细胞内色素颗粒增大显著，部分肝细胞嗜酸性变及气球样变，点状或灶状坏死，部分肝细胞脂肪变性。汇管区明显炎性细胞浸润，小胆管增生，胆栓形成。B组大鼠镜下观察，肝小叶清晰可见，中央静脉、汇管区结构正常，肝