邻苯二甲酸二丁酯酶联免疫分析方法建立ぜ罢蚪地区水体污染调查研究.docVIP

邻苯二甲酸二丁酯酶联免疫分析方法建立ぜ罢蚪地区水体污染调查研究 　　摘要：采用制备的邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体建立可检测环境水体中痕量邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的间接竞争酶联免疫（ELISA）分析方法，对各种参数进行优化后，在最??条件下本方法具有较高的灵敏度（检测限为 66.6 ng/mL）、较宽的检测范围（70～1 600 ng/mL）、较好的准确度（回收率82.8%～104.0%）。利用此高通量分析方法对镇江部分河流中水样、底泥进行分析，结果发现镇江市区几处河流，DBP普遍检出，水样中DBP浓度为76.5～140.4 ng/mL，底泥中DBP浓度可达114.6～248.7 ng/g。 　　关键词：邻苯二甲酸二丁酯；酶联免疫；抗体；水体；镇江 　　中图分类号：X824文献标志码：A 　　文章编号：1002-1302（2017）05-0289-03 　　邻苯二甲酸酯类物质（phthalateesters，PAEs）是一类大量应用于塑料及一次性塑料消费品（食品包装材料、容器、医疗用品）的增塑剂，还可以作为原料用于香味剂、化妆品和冷凝剂，这类化合物的使用，造成了全球性的污染[1]。其中，邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在被检出的PAEs样品中分布最为广泛[2]，Fatoki等对南非East London港中DBP浓度进行了分析，其含量可达2.8～121.9 ng/mL[3]；Adeniyi等报道称尼日利亚的河水中DBP的含量为202.5～270.5 ng/mL[4]；陆继龙等对第二松花江中下游中DBP浓度进行了测定，其平均浓度高达717.24 ng/mL[5]。同时，研究表明，DBP具有明显的生殖毒性：可以引起染色体丢失或断裂等畸变，阻碍正常精子的生成[6]；可导致雄性兔与大鼠生殖道畸形，睾丸萎缩，从而造成其生殖系统损伤[7]。因此，建立简单、快速高通量的分析方法，对水体中此类污染物进行分析极其必要。DBP分子的化学结构如图1所示。 　　目前报道的有关分析DBP的方法主要有气相色谱-质谱法[8]、液相色谱法[9]、LC-MS/MS[10-11]等仪器方法，然而，由于这类方法存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大（通常大于500 mL）及前处理步骤繁琐等不足，无法在较大范围内系统、全面、快速分析环境水体中DBP的含量。与此相比，酶联免疫法（ELISA）具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测成本低、适合高通量分析的优势。因此，本研究利用自主制备的DBP多克隆抗体，建立了高灵敏的ELISA方法，优化了影响方法灵敏度与准确度的各种因素，并以此方法对镇江地区部分小型浅水河流中DBP的污染状况进行了调查。 　　1材料和方法 　　1.1材料和试剂 　　DBP抗原抗体，由江苏大学环境科学团队制备；邻苯二甲酸二丁酯标准品、乙酸乙酯、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、四甲基联胺，均购自美国Sigma公司；Tween-20、十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）、二水磷酸二氢钠（NaH2PO4?2H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸钠（Na2CO3）、碳酸氢钠（NaHCO3）、浓硫酸（H2SO4）等，均购自国药集团化学试剂有限公司，且均为分析纯；酶标板，购自丹麦NUNC公司。 　　碳酸盐包被缓冲液CB：0.05 mol/L、pH值为9.6；封闭液：含1%明胶的CB液；洗涤液PBST：0.01 mol/L、pH值为7.4、含体积分数0.05% Tween-20的PBS液；抗体稀释液：0.01 mol/L、pH值为7.4、0.01% Tween-20、0.1%明胶的PBS液；显色液：10 mg邻苯二胺、25 mL柠檬酸钠缓冲液、5 μL 30%过氧化氢，用时混合；终止液：2 mol/L H2SO4。 　　1.2仪器设备 　　电子分析天平，购自重庆CoiC公司；恒温培养箱，上海精密科学仪器有限公司；酶标仪，购自美国Thermo公司。 　　1.3间接竞争酶联免疫分析方法（ic-ELISA）的建立 　　采用方阵滴定法，确定抗原最佳包被浓度、抗体最佳包被浓度，为达到最佳检测条件，对孵育条件、封闭时间、一抗竞争时间、二抗稀释倍数、pH值、离子强度等影响因素进行优化。 　　具体ic-ELISA操作步骤为：（1）包被：用包被液将稀释的包被原加至酶标板，100 μL/孔，4 ℃过夜孵育；（2）洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗3遍，200 μL/孔，在吸水纸上拍干；（3）封闭：加入150 μL/孔封闭液，37 ℃孵育1 h；（4）洗涤：倾去孔内液体，用200 μL洗涤液洗1遍，在吸水纸上拍干；（5）加样：每孔加入50 μL不同浓度的标准品和适当稀释的待检