酿酒酵母紫外诱变选育及发酵条件研究.docVIP

酿酒酵母紫外诱变选育及发酵条件研究 　　摘要：以果园土为菌种来源，采用平板分离法得到5种酵母菌，对其进行紫外线诱变，筛选出7株酵母菌突变株，通过测定突变株的发酵性能，从中筛选出1株液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及发酵力均较好的酵母突变株N4-4，其发酵液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和发酵力比对照菌株分别提高了6.7%、7.5%、8.1%和39.0%，通过单因素和正交试验确定该突变株的最佳发酵条件。结果表明，在30 ℃、120 r/min的培养条件下，突变株最佳发酵条件为3%葡萄糖、3%（NH4）2SO4、pH 5.0、3%接种量（V∶V）。 　　关键词：酵母菌；紫外线诱变；发酵条件 　　中图分类号：TS261.1；Q93.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）07-1664-04 　　酵母菌是白酒发酵过程中的一种重要微生物，白酒风味的形成与发酵过程中各种酵母菌息息相关[1]。酵母菌的主要作用是将原料糖化后的绝大部分糖类物质转化为乙醇和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、酯、醛等代谢产物，直接影响着白酒的色泽、香气及口感，决定着白酒的质量。酵母菌的发酵特性常常因菌株的不同而存在明显的差异[2]，野生型酵母菌在工业发酵过程中不可避免地受到胁迫条件（如乙醇毒性、高温胁迫等）的影响，最终影响到乙醇产率和白酒品质以及其经济效益。工业上常常采用紫外线诱变的方法，对酿酒酵母工业菌株进行改良来提高菌株对胁迫条件的耐受性[3]。本试验采用紫外线诱变的方法对果园土中分离到的5株酵母菌进行诱变，以期筛选出发酵力较高的突变株，为提高白酒的产量和质量提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　菌种来源：分离自陕西省周至县邵家堡村苹果园土壤中。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 酵母菌分离、纯化和菌种保藏 酵母菌的分离、纯化和菌种保藏参考文献[4-6]。 　　1.2.2 不同菌株发酵性能测定 将分离得到的菌株分别制成酒曲后用常压干燥法测定水分含量；采用酸碱滴定法测定酸度；采用碘量法测定液化酶活力；采用DNS法测定糖化酶活力；采用福林-酚法测定蛋白酶活力；采用CO2失重法测定发酵力[7，8]。 　　1.2.3 紫外线（UV）诱变 选取发酵性能最好的菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶中，130 r/min振荡培养，于28 ℃恒温培养箱培养48 h，得到对数生长阶段的酿酒酵母菌悬液[9]。再用麦芽汁液体培养基将菌悬液稀释，使菌种的浓度达到1×106 个/mL。打开紫外灯（15 W），预照射20 min，使其功率达到稳定。取4 mL菌悬液放入直径为9 cm的无菌培养皿中，将培养皿平放在距紫外灯30 cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上，启动磁力搅拌器，照射0、1、2、3、4、5、6 min后将菌液在黑暗中冷冻保存1～2 h，然后在红灯下稀释至1×10-6个/mL，并涂布平板，28 ℃恒温培养48 h，计算菌株致死率，保存致死率在75%以上的孤立菌落[10]。 　　1.2.4 优良突变株的筛选 在“1.2.3”的基础上进行筛选，筛选方法同“1.2.2”。 　　1.2.5 优良突变株最优发酵条件筛选 　　1）pH试验：将液体培养基的初始pH分别调至3、4、5、8、9、10，接种1%的优良突变株。30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。 　　2）碳源试验：制备含3%的不同碳源（葡萄糖、果糖、麸皮、麦芽糖、甘露糖、乳糖）的培养液，接种1%的优良突变株，30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。 　　3）氮源试验：制备含2%的不同氮源[蛋白胨、黄豆粉、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、（NH4）2SO4]的培养液，接种1%的优良突变株，30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。 　　4）接种量试验：制备100 mL液体培养基，分别接种2%、4%、6%、8%、10%的优良突变株，30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。 　　1.2.6 正交试验 根据单因素试验结果设计正交试验，选择4因素3水平进行试验，正交试验因素和水平见表1。 　　2 结果与分析 　　2.1 酵母菌的分离、纯化结果 　　经反复分离纯化筛选出5种酵母菌，其菌落形态特征见表2。 　　2.2 菌株发酵性能 　　将所筛选的5种酵母菌分别制成酒曲，测定其部分理化指标，结果见表3。由表3可知，酒曲N2、N4的水分含量均在12%～13%，酸度在1.1 mmol/100 g以上，研究表明，酸度在0.9～1.3 mmol/100 g的为一级酒曲，在0.6～0.9 mmol/