重症胰腺炎肺损伤大鼠磷脂酰肌醇―3激酶表达及其抑制剂对肿瘤坏死因子―α表达影响.docVIP

重症胰腺炎肺损伤大鼠磷脂酰肌醇―3激酶表达及其抑制剂对肿瘤坏死因子―α表达影响 　　DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.01.014 　　作者单位：450052 郑州，郑州大学第五附属医院检验科 　　通信作者：魏明，Email：gushiweiming@126.com 　　急性肺损伤（ALI）是重症急性胰腺炎（SAP）常见且严重的并发症之一，若不及时干预将进一步发展成急性呼吸窘迫综合征（ARDS）[1]。目前研究结果显示ALI是一种介质病，中性粒细胞的活化、浸润及大量炎症介质的释放，可造成肺组织及其毛细血管的损伤，从而使肺损伤加重[2-4]。已有研究显示磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）通路在中性粒细胞的活化过程中起重要作用[5-6]，而沃特曼青霉素（Wortmannin）是PI3K的抑制剂，关于它能否减轻SAP时肺组织的损伤，目前报道尚少。我们通过建立大鼠SAP-ALI模型，观察SAP时PI3K/PKB通路活性变化，并应用Wortmannin来阻断该通路之后观察肺损伤的变化，探讨Wortmannin能否对SAP时肺组织损伤起到保护作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物分组与SAP-ALI模型的建立 　　健康成年雄性SD大鼠70只（购自郑州大学实验动物中心），体质量320～360 g，随机（随机数字法）分成假手术（SO）组（n=10）、SAP组（n=30）、SAP+Wortmannin（SAP+W）组（n=30）;SAP组与SAP+W组再分为3、6、12 h 3个亚组，每组各10只。大鼠术前12 h禁食，自由饮水，常规麻醉消毒铺巾，经上腹正中切口进腹，采用外径0.75 mm BD针于十二指肠外侧壁戳入肠管内，拔出针心，沿乳头方向探入胆胰管1.0～1.5 cm，以0.2 mL/min的速度向胰胆管内匀速注入4%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g，购自Sigma公司）构建模型。SAP+W组于造模前2 h腹腔注射Wortmannin 1.4 mg/kg，SAP组与SO组均于造模前用同样方法给予等量对应溶剂（生理盐水）。SO组除开腹后仅翻动肠管外，其余操作同SAP组。SAP组、SAP+W组术后3、6、12 h活杀取材，SO组于12 h活杀取材。 　　1.2 大鼠肺含水率检测及病理学观察 　　 取右下肺叶，滤纸吸干表面渗液及血迹，称湿质量后，置于80 ℃的烤箱中烘烤48 h至恒重，称干质量，计算肺含水率（%）=（湿质量-干质量）/干质量×100%。常规制作石蜡切片并苏木素-伊红（HE）染色。采用Schmidt[7]及Mayer等[8]评分标准对胰、肺组织进行病损严重度分析。 　　1.3 大鼠肺髓过氧化物酶（MPO）活性测定 　　 称取一定量肺组织制备组织匀浆，严格按照试剂盒（南京建成生物试剂公司）说明书操作。 　　1.4 大鼠肺组织肿瘤坏死因子（TNF）-α检测 　　 采用免疫组织化学法，兔抗大鼠单克隆抗体由Cell Sig-naling Technology公司提供。每只大鼠选3张结构完整的切片，在100倍显微镜下观察，用OlympusDE70CCD采集图像，阳性标准：肺泡上皮皮细胞和血管上皮细胞胞质出现棕黄色或核内有棕黄色颗粒。应用Image-pro plus 6.0免疫组织化学彩色图像分析系统对免疫组织化学结果进行定量分析，以图片中的1个阳性点（单个细胞或细胞团）为基础，分析测定整幅图片的阳性点个数、面积、积分吸光度值（IA）等参数。 　　1.5 Western blot法检测大鼠肺组织中PKB和 　　p-PKB的表达 　　 取肺组织约0.5 mg，置于组织匀浆器中，加入1 mL总蛋白提取液后冰浴下超声匀浆，提取总蛋白，采用内参照法行总蛋白定量。取25 μL/孔，行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）电泳2 h，然后转至硝酸纤维素（NC）膜上，加入兔抗鼠PKB（1∶400稀释）和兔抗鼠p-PKB单克隆抗体（1∶1000稀释），4 ℃过夜;加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶40 000稀释）;增强化学发光（ECL）法显示结果，X线片曝光显影，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照。采用Gelpro 4.0版凝胶吸光度分析软件以及Image-pro plus 6.0软件分析结果，以相应条带灰度值表示相对蛋白含量。 　　1.6 统计学方法 　　 应用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用成组t检验，相关性检验采用线性相关分析。以P0.05为差异具有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 大鼠肺含水率、肺M