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重组人胶原蛋白微生物限度检查方法建设及验证 　　摘 要：目的：建立重组人胶原蛋白原料的微生物限度检测方法及控制菌检测方法，并进行方法学验证，用于重组人胶原蛋白原料的质量控制。方法：依据《中国药典》2015版四部通则1105和1106，对重组人胶原蛋白原料需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数进行检测，并对控制菌进行检测。结果：连续3批重组人胶原蛋白原料回收率范围在0.8-1.2之间，符合规定；控制菌检测方法符合规定。结论：重组人胶原蛋白需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检测采用直接接种法，控制菌检测采用常规法。 　　关键词：人胶原蛋白；微生物限度；方法建设；方法学验证。 　　中图分类号：S961.6 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）35-0098-02 　　前言 　　重组人胶原蛋白是通过生物技术手段构建的工程菌株，经发酵，分离纯化制备的器械原料，其主要成分为重组人胶原蛋白。根据现行标准，应进行细菌总数、霉菌和酵母菌总数以及控制菌检查，根据中国药典2015版四部通则1105，1106规定[1]，建立重组人胶原蛋白原料的微生物限度检查方法，验证培养基灵敏度，并进行方法适用性检查，为重组人胶原蛋白原料建立符合质量控制要求的检测方法。 　　1 设备材料 　　1.1 材料 　　胰酪大豆胨琼脂培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，胰酪大豆胨液体培养基，沙氏葡萄糖液体培养基，麦康凯液体培养基，麦康凯琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基均购自陕西标普，氯化钠，聚山梨酯80。 　　高压灭菌锅（上海申安），超净工作台（苏净净化），分析天平（万分之一，奥豪斯），生化培养箱（上海博泰），水浴锅。 　　金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）44102]，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]，大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]均购自陕西标普，各菌种的工作菌种均传至第3代。 　　1.2 供试品 　　本公司按规定工艺生产的连续3批重组人胶原蛋白冻干海绵，批号分别为：201704010，201704011，201704012。 　　2 实验方法 　　2.1 菌液制备 　　接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，大肠埃希菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养48小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌孢子悬液。 　　2.2 供试品制备 　　称取供试品1g，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10ml，配制成1：10供试品溶液。 　　2.3 直接接种法方法适用性检查 　　2.3.1 供试品组制备 　　取90mm无菌平皿6块，每块加入1ml供试品溶液，3块平皿注入15-20ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固，33℃倒置培养3天，逐日观察；3块平皿注入15-20ml的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固，25℃倒置培养5天，逐日观察。 　　2.3.2 实验组制备 　　取90mm无菌平皿15块，每块加入1ml供试品溶液，再各吸取1ml小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉至3块平皿，注入15-20ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固，33℃倒置培养3天，逐日观察；取90mm无菌平皿6块，每块平皿加入1ml供试品溶液，再各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3块平皿，注入15-20ml的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固，25℃倒置培养5天，逐日观察。 　　2.3.3 阳性组制备 　　取90mm无菌平皿15块，各吸取1ml小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉至3块平皿，均注入15-20ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固后，33℃倒置培养3天，逐日观察；取90mm无菌平皿6块，各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3块平皿，均注入15-20ml的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后，25℃倒置培养3天，逐日观察。 　　2.3.4 阴性组制备