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钝顶节旋藻羧酶体操纵子克隆与分析 　　摘要 利用高通量测序技术Solexa,测得了钝顶节旋藻AGB-AP02(Arthrospira platensis AGB-AP02)的全基因组序列。在基因组中发现了编码羧酶体的操纵子,这些基因同集胞藻PCC 6803中相应的基因具有较高的同源性,该操纵子在Genebank上的登录号是HM179535。在整个基因组中没有发现编码碳酸酐酶的基因,同时发现蛋白ABT4具有典型的γ-碳酸酐酶 N-末端的三维结构与催化活性位点。通过Mega 3.1建树分析,蛋白ABT4与M.Thermophila的γ-碳酸酐酶聚在一支。推测ABT4蛋白在羧酶体中同时发挥碳酸酐酶与结构蛋白的作用。 　　关键词 钝顶节旋藻;羧酶体操纵子;克隆;分析 　　中图分类号 Q943;X17 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2010)11-0011-02 　　 　　钝顶节旋藻含有多种营养成分,被认为是人类健康食品[1],具有重要的经济价值。钝顶节旋藻生活的环境中CO32-与HCO3-的含量高,CO2浓度极低,在这种特殊的无机碳环境条件下,节旋藻对无机碳源的利用必定有它特殊的机制。通过对节旋藻无机碳源利用机制的研究,一方面能丰富对蓝藻无机碳利用机制的了解,另一方面对钝顶节旋藻的育种有重要的指导作用。当前对钝顶节旋藻无机碳利用研究主要集中在对其生理学的研究上[2-4],然而有关钝顶节旋藻对无机碳利用的分子机制了解相对较少,相关基因只有R-ubisco大小亚基基因(rbcLXS)克隆并报道[5-6]。为了了解钝顶节旋藻的CCM分子基础,本研究克隆了钝顶节旋藻编码羧酶体的操纵子,并利用生物信息方法对相关基因进行了初步分析。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　钝顶节旋藻(Arthrospira platensis AGB-AP02)购自于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库,并保存于中国海洋大学藻类研究室。 　　1.2方法 　　1.2.1藻体纯化。为了纯化藻体,挑取钝顶节旋藻AGB-AP02的单藻丝在Zarrouk培养基中培养,培养光照条件为30.5～33.5 μE/(M2?S),光照周期为光照、黑暗交替,各12 h,培养温度(23±1) ℃。当培养到对数生长期OD560 nm=0.4,收集藻体。 　　1.2.2基因组DNA的制备、基因组测序及组装。参阅Ling等[7]制备钝顶节旋藻AGB-AP02基因组DNA的方法制备基因组DNA,共获得基因组DNA总量为64.2μg,制得的DNA溶液OD260 nm/280 nm=1.79,OD260 nm /230 nm=1.88,以上结果显示,基因组DNA质量符合Solexa测序要求。委托华大基因研究院利用Solexa技术对钝顶节旋藻AGB-AP02的全基因组进行测序,测序及组装过程参阅Li等[8]对大熊猫基因组的测序与组装过程。 　　1.2.3基因组ORF的预测及功能注释。用Glimmer3对组装后的Scaffold序列进行ORFs预测,把所有的ORFs同COG、KEGG、SWISSPROT与TrEMBL数据库比对,从而对ORFs进行注释,只选一个最可靠的注释,然后从ORF注释表中找出羧酶体相关的基因。 　　1.2.4钝顶节旋藻CCM相关基因的分析。利用/seq_tools/promoter.html的原核生物启动子预测软件对编码羧酶体操纵子的启动子与终止子进行预测。利用Mega3.1对碳酸酐酶进行系统发生树的构建。 　　2结果与分析 　　2.1编码羧酶体操纵子的分析 　　2.1.1测序结果及基因的排列顺序。该操纵子共包含碱基数5 296 bp,共包含了6个ORFs分别是ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5与ORF6,它们的长度分别为295、342、309、1 641、525、801 bp。ORF1、ORF2同集胞藻PCC6803中ccmK1基因的同源性分别是73.40%、75.44%。ORF3、ORF4、ORF5、ORF6同集胞藻PCC6803中的ccmL、ccmM、ccmN、ccmO的同源性分别是55.66%、43.73%、35.44%、53.45%,比较这2个操纵子的结构发现,在钝顶节旋藻AGB-AP02羧酶体操纵子中没有发现rbcL、rbcS与ccaA基因,这些基因被编码CO2转运蛋白复合体NdhF3-NdhD4-chX的基因簇所代替。 　　2.1.2操纵子启动子的与终止子的预测。启动子预测发现,在起始密码子ATG上游223 bp处发现了转录起始位点A。在ATG上游处268~219 bp处发现启动子序列。其中发现了-10区的序列为TATTAA与-35区的序列为TTGTTT,这2个序列与典型的-10区序列(TATAAT bo