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香蕉枯萎病菌毒素成分分析及其生物测定 　　摘要:提取了香蕉枯萎病菌4号小种的毒素,利用高效液谱、气、质联用仪对其成分分析和生物测定。成分分析结果表明,香蕉枯萎病菌毒素共有7种成分,其色谱峰积分百分含量分别为5.81%、5.94%、6.31%、2.80%、3.42%、73.34%、2.37%。其中第6个组分――镰刀菌酸是毒素中的主要成分,是引起香蕉枯萎症状的主要物质。另外6种成分在致枯萎过程中起到增效作用。生物测定结果表明,同浓度的毒素和商品镰刀菌酸引起香蕉苗的枯萎作用相比,香蕉枯萎病菌毒素作用更强。毒素对不同品种的蕉苗和作物都可以引起萎蔫,没有选择性,该毒素是一种非寄主专化性毒素;毒害作用随着毒素溶液浓度的升高而加强。 　　关键词:香蕉枯萎病;毒素;成分分析;生物测定 　　中图分类号:S668.1　文献标识码:A　文章编号:1009-9980(2010)06-969-06 　　 　　由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病,是一种毁灭性病害,该病害在亚洲、非洲及热带的美洲等香蕉产区均有分布,我国台湾、广东、广西、福建和海南等地也有发生。国内外对由尖孢镰刀菌引起植物维管束枯萎,其病原菌可产生致病的毒素,对毒素的致病作用研究和毒素对抗病品种的筛选等方面的研究比较多。国内尚未有关于香蕉枯萎病病原菌所产毒素成分分析的报道,我们提取了香蕉枯萎病菌4号小种的毒素,并进一步对毒素进行成分分析和生物测定,为研究寄主抗毒素机制及防治技术提供理论依据,对加快抗病育种进程有重要意义。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　1.1.1　供试菌株供试病菌分离自田间得病的香蕉植株,经致病性测定对香蕉具致病力的4号生理小种。菌种贮藏在广东海洋大学生物技术研究所。 　　1.1.2　供试香蕉苗　巴西蕉(感病品种)、8818(感病品种)、新北蕉(耐病品种)和广粉一号(粉蕉,感病品种)的组培苗,供试香蕉苗为6叶期,根部洗净并做伤根处理,香蕉组培苗均由广东省农业科学院果树研究所提供。 　　1.1.3　供试种子小麦、玉米、黄豆、豆角、茄子、辣椒、白菜、菜心、丝瓜和黄瓜等,来源于商品种子。 　　1.2　方法 　　1.2.1　毒素的提取FOC-4菌株毒素的提取参照许文耀等的方法并作改进。 　　1.2.2　毒素成分分析(1)高效液相色谱分析。以商品镰刀菌酸(FA,SIGMA公司)为标样,对毒素进行高效液相色谱分析。仪器:Agilent-1100型高效液相色谱仪:在线真空脱气机;四元梯度泵;DAD二极阵列检测器:自动进样器;HP-A.09.01化学工作站;GrantxBl4超声波清洗器:ORIO-868酸度计。色谱柱:Hypersil-OPS C18柱5μm,200 mm×4.6 mm,I,d。色谱操作条件:流动相一甲醇:H2O(V,v)=85:15;检测器一荧光检测器,激发波长274 nm,发射波长460nm,进样量4μL。 　　(2)色谱/质谱(Gc/MS)鉴定。利用日本岛津公司OP20lO型气相色谱/质谱联用仪对毒素进行成分分析。气相色谱条件:安捷伦公司DB-5MS弹性石英毛细管色谱柱(30mx0.25 minx0.25μm);载气:高纯氦气,纯度99,999%;恒流模式:流动速度为1mL?min-1:程序升温:50℃保持1 min,以3℃?min-1升至250℃,保持10min;进样口分流:分流比为40:1,进样口温度为220℃,接口温度为250℃,进样量为1.0 μL乙醚溶液(手动式进样)。质谱条件:EI电离源,电子能量70 eV,光电倍增器管电压200 V,质量扫描范围33 ainu-40 amtl,全扫描方式,离子源温度200℃。 　　1.2.3　毒素的生物活性测定主要有以下几项:1)毒素溶液的配制。用少量95%的乙醇溶解毒素粗结晶,然后用蒸馏水配制成所需浓度的毒素溶液(毒素溶液内乙醇含量不能超过0.5%,预备实验证明乙醇含量低于0.5%的水溶液对香蕉幼苗及其他作物种子和幼苗生长表现均无异常影响)。 　　2)标准曲线。用商品FA准确配制成浓度分别为20、40、60、80、100 mg?mL-1的系列标样溶液。测定其D,作出以浓度为纵坐标、D为横坐标的FA标准曲线。配制浓度分别为50、100、200 mg?L-1的毒素溶液,测定其D224nm,根据标准曲线求出该浓度毒素溶液中FA的含量,据此用商品FA配制成相应等量FA浓度的溶液。 　　3)毒素对香蕉苗致病力的比较。将根部处理的8818香蕉苗直接浸入40 mL浓度分别为50、100、200 mg?L-1的毒素溶液和商品FA溶液的组培瓶中,每瓶l株,每个处理设8株苗。 　　 　　4)毒素对不同品种香蕉苗的致病作用比较。将根部处理巴西蕉、8818、新北蕉和粉蕉(