乙型病毒性肝炎患者血清学标志物与HBV DNA定量相关性分析.docVIP

乙型病毒性肝炎患者血清学标志物与HBV DNA定量相关性分析 　　作者简介：周方满（1963— ），男，副主任技师。 　　我国属乙型病毒性肝炎（乙肝）高流行地区，一般人群HBsAg阳性率为7.2%[1]。目前临床上诊断乙肝一般采用ELISA法检测乙肝血清标志物。随着基因诊断技术的不断发展，采用实时荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA数量也逐渐在临床普及。为了探讨乙肝5项血清标志物与HBV DNA两者之间的相关性，我们运用两种方法同时检测乙肝病毒感染者血清，并对其结果进行分析，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本来源与采集 　　标本来自2010年1月—2011年12月我院门诊及住院的乙肝患者，共850例，其中男520例，女330例，年龄8～59周岁，平均32.4岁。采集所有患者空腹静脉血4 mL，分离血清，置-20℃保存待查。 　　1.2 仪器 　　所用仪器有伯乐BIO-RAD 680酶标仪，伯乐BIO-RAD Model 1575全自动酶标洗板机，DA 7600 PCR扩增仪。 　　1.3 试剂 　　HBV血清5项标志物检测（ELISA法）试剂盒由上海科华生物工程有限公司提供，HBV DNA实时荧光定量PCR法检测试剂盒由广州中山医科达安基因诊断中心提供。 　　1.4 方法 　　1.4.1 HBVm检测 采用ELISA法，严格按照试剂说明书操作及判读结果。 　　1.4.2 HBV DNA荧光定量检测 ① DNA提取：取100 μL血清加入等量DNA浓缩液，振荡器振荡混匀5 s，12 000 r/min离心10min，去上清，沉淀物中加入20 μL DNA提取液，振荡器剧烈振荡混匀5～10 s，瞬间离心数秒，100℃恒温处理（10±1） min，12 000 r/min离心5 min，备用。② PCR扩增：取PCR反应管，分别加入处理后的样品上清液、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品2 μL，8 000 r/min离心数秒，放入仪器样品槽，经过93℃ 2 min 1个循环；93℃45 s→55℃60 s，10个循环；93℃ 30 s→55℃ 45 s，30个循环后，仪器读取荧光值进行结果分析，所有步骤严格按照试剂和仪器说明书操作。 　　1.5 统计学分析 　　使用统计软件SPSS 13.0对结果进行处理，HBV DNA含量正常参考值为1.0×103 copies/mL， ≥1.0×103 copies/mL判断为阳性。 　　2 结果 　　在大三阳组病人血清标本中HBV DNA检出率为95.7%，小三阳组病人血清标本中HBV DNA检出率为45.8%，明显高于其他各组（表1）。 　　3 讨论 　　HBV感染病原学诊断的传统指标多采用ELISA法检测血清标本中的HBV抗原及抗体，即HBVm，该法简单易行，能基本满足临床诊断需要，但由于个体反应的差异，不同的人在感染HBV后会出现不同的免疫应答，从而得到不同的乙肝血清标志物模式。乙肝血清标志物模式不能直接反映患者或患者体内病毒的复制水平及传染程度，不能提示其与乙型肝炎的发生和发展过程之间的联系，特别是在要求准确判断血清有无感染的情况，如：怀孕、输血、器官移植、医务人员的意外刺伤等，其检测结果难以达到要求。此次研究通过分析乙肝患者血清HBVm和HBV DNA含量的关系，有利于我们发现病毒和血清标志物的深层关系。 　　本次研究对850例乙肝患者血清标本同步进行HBVm和HBV DNA检测，共检出HBV DNA阳性标本507例，总检出率为59.6%。其中323例“大三阳”标本中检测到HBV DNA阳性309例，检出率高达95.7%，平均HBV DNA拷贝数为3.37×107 copies/mL，明显高于其他组；HBeAg阳性组的HBV DNA检出率和HBV DNA含量明显高于HBeAg阴性组，显示HBV复制与HBeAg存在某种关系[2]，反映病毒复制活跃，传染性强，应引起医师和患者的高度重视。但仍有14例大三阳患者其血清HBV DNA为阴性，这种情况应考虑HBV基因的S区发生有意义的点突变、插入或缺失突变[3]，也有可能是由于患者体内HBV DNA复制水平已经很低，而在此之前所表达的HBeAg尚未完全降解，仍处于较低水平。在“小三阳”患者中，HBV DNA阳性132例，检出率为48.5%，平均HBV DNA拷贝数为1.56×105 copies/mL。这一结果表明HBeAg转阴，事实上仍有部分患者存在HBV活动性复制，有可能为前C区和BCP区的变异，前C区最常见的变异为C1896A点突变，形成终止密码子（TAG），不显示HBeAg；BCP区最常见的变异是A1762T/G1764A联合点突变，选择性地抑制了前CmRNA转