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黑曲霉液态发酵制备没食子酸工艺研究 　　摘要：采用高效液相色谱测定黑曲霉B0201制备的没食子酸，对底物添加方式、底物浓度、转化方式及转化条件等因素进行研究。最终确定较佳工艺条件为：用五倍子直接作为产酶的诱导物及转化底物，底物分4次添加，每次间隔12h，最终总浓度达6%，转化过程中搅拌速度优化为200r/min，温度为35℃，没食子酸浓度可达到39.78mg/mL，转化率达最大值73.05%。在对菌丝重复转化试验过程中补加营养物质及调节pH值均能提高转化产物浓度。 　　关键词：黑曲霉；液态发酵；五倍子；生物转化；没食子酸；工艺优化 　　中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0250-04 　　没食子酸（gallicacid，GA）又名五倍子酸，为白色或淡黄色针状结晶，化学性质活泼，能形成多种酯类、酰卤和酰胺，可以通过氧化耦合反应制得鞣花酸、脱氢二鞣花酸等联苯型化合物，是一种重要的精细化学品，广泛应用于矿产、化工、农业、食品、制药等行业。目前，没食子酸的制备方法可分为化学法与生物法，工业上没食子酸主要是由化学法经酸或碱水解五倍子制得，其工艺存在对环境污染严重、副反应多、杂质含量较高等问题。而生物法因具有反应条件相对温和、对设备要求低、副产物较少、对环境友好以及岳续提纯工艺较为简单等诸多优点，近年来受到国内外相关学者的广泛关注。五倍子富含单宁酸，研究表明单宁酸诱导黑曲霉液态发酵产胞内单宁酶，单宁酶可高效、专一、定向裂解单宁酸分子，生成没食子酸；故直接将五倍子投入发酵系统中，利用菌体内的单宁酶将之转化为没食子酸。当转化趋于平衡后，分离菌丝体并洗涤，可反复转化五倍子制备没食子酸。此过程不需要将酶从菌体中分离，将酶的生成与五倍子单宁酸转化没食子酸的过程相耦合，简化了没食子酸的生物转化过程。与酶法转化相比，此方法转化底物浓度有很大倍数的提高，产物浓度也有很大提高。同时，分光光度法与高效液相色谱法相比，测定没食子酸是前者由于单宁酸和没食子酸结构相近，最大吸收峰波长也较近产生累加效应，因此产生的干扰比较大，实际测量值会偏大。本试验通过对底物添加方式、底物浓度、转化方式及转化条件等因素进行研究，以提高没食子酸相对于五倍子中单宁酸的转化率，为生物法制备没食子酸的工业化应用奠定基础。 　　1.材料与方法 　　1.1试验材料与仪器 　　1.1.1菌株黑曲霉B0201（Aspergillusniger），由笔者所在实验室保藏。 　　1.1.2培养基斜面培养基：察氏培养基；液态基础培养基：蔗糖2.0g，NaNO30.2g，K2HPO4?3H2O0.1g，KCl0.05g，MgSO4?7H2O0.05g，FeSO4?7H2O0.001g，溶于100mL蒸馏水中，pH值自然。 　　1.1.3主要试剂五倍子，购于贵州省遵义市余庆县；单宁酸C76H52O46，分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；没食子酸C7H6O5?H2O，分析纯，购于贵州迪大生物有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。 　　1.1.4主要试验仪器722S分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；FA-1004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；MJ-160B-II霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；Anke TDL-5离心机（上海安亭科学仪器厂）；XMTD-204双功能蒸汽振荡器（金坛市文华仪器制造有限公司）；岛津LC-10AVP高效液相色谱仪（岛津有限公司）。 　　1.2试验方法 　　1.2.1产酶 　　1.2.1.1菌种的活化将保存的黑曲霉B0201转接到察氏斜面培养基后，放入霉菌培养箱中，于30℃条件下培养3～4d后，保存备用。 　　1.2.1.2种子悬浮液的制备斜面试管加入10mL生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得108个/mL左右的孢子悬浮液。 　　1.2.1.3黑曲霉B0201发酵产酶在灭菌的液态基础培养基中添加4%的五倍子，接种量2%，装液量100mL/250mL，摇匀后用纱布封口置于140r/min、30℃的摇床中培养72h，完成发酵产酶过程。 　　1.2.2没食子酸的制备 　　在产酶系统中直接添加底物转化五倍子单宁酸制备没食子酸。 　　1.2.3单宁酸转化率的测定 　　1.2.3.1没食子酸相对于单宁酸的转化率计算 　　1.2.3.2 　　单宁酸的测定 　　参考国家标准GB/T15686-1995，用紫外分光光度法测定单宁酸含量。（1）单宁酸标准曲线的绘制。配制不同浓度的标准溶液，再加入2.0mL磷钼钨酸试液和10.0mL饱和碳酸钠溶液，定容到50mL，静置30min后于4000r/min离心5min，720nm下光谱扫描。以吸收峰值D为纵坐标，样品浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标