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龙眼梅PGIP基因克隆及序列分析 　　摘　要：利用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在龙眼梅(Prunus mume Sieb et Zucc.Longyan)嫩芽中特异性表达的PGIP基因。DNA序列分析表明，所获得龙眼梅的PGIP eDNA的序列全长为1045bp，该序列与已发表的PGIP基因有很高的同源性。 　　关键词：龙眼梅；PGIP基因；克隆 　　中图分类号：S662.4　文献标识码：A　文章编号：1009－9980(2007)01－55－04 　　 　　龙眼梅(Prunus mume Sieb et Zucc.Longyan)是中国南方特产名果之一，其风味独特，营养丰富，药用价值高，被誉为保健食品，深受国内外消费者的喜爱。龙眼梅的果实因含酸量较高，很少用于鲜食。大部分用于加工，但由于果实采后迅速软化，给贮运和加工带来很大的困难，尤其是交通不便的山区。果实采收后，因果实的软化，在加工前出现品质下降，甚至大量腐烂，给生产带来很大的经济损失。因此。选育出抗软化和抗病虫害的龙眼梅品种是急需解决的问题，也是解决龙眼梅果实软化的主要途径之一。 　　多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonaseinhibiting protein.PGIP)是一种富含亮氨酸(LRR)的蛋白质家族成员之一，能够非竞争性地抑制多种植物病理性真菌的内聚半乳糖醛酸酶(Polygalactur-onase，PGs)的酶活性，促进寡半乳糖醛酸酶的增加，抑制植物细胞壁果胶的溶解，增加植物的抗毒素，激活植物的防御系统。PGIP基因可以干扰灰霉菌等多种真菌病害对植物组织的侵染过程，从而抑制这些真菌病害的发生。PGIP基因还与果实的发育过程、胁迫反应、冷藏、浆果果实的病虫害等有一定关系。因而，PGIP基因受到国内外研究者的高度重视并成为目前抗病虫害基因工程和果实耐贮藏基因工程研究的焦点。 　　本文以龙眼梅嫩芽为材料，对其PGIP(cDNA)基因进行克隆和测序，为进一步开展转基因育种工作奠定了基础。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1 材料 　　植物材料龙眼梅嫩芽采自福建农林大学校园，液氮速冻，放-70℃冰箱保存备用。自制大肠杆菌DH5α；载体pGEMR-TEasy vector购于Promega公司；玻璃奶法回收片段试剂盒购于北京原平皓公司。由上海生工生物工程公司测序。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1 总RNA的提取及纯化 总RNA的提取采用Trizol提取试剂盒。 　　1．2．2 基因组RNA含量和纯度的测定 取2μL基因组RNA样品稀释50倍，在Ultrospec 2100 Pro紫外分析仪上测定D260nm、D280nm、D260nm／D280nm、RNA含量(μg/μL)。 　　1．2．3 基因组RNA的电泳分析 取5μL RNA样品在1.0％琼脂糖凝胶、电泳缓冲液为1×TAE，电压为120V的条件下电泳20min，溴化乙锭染色，在凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、完整性、电泳条带的清晰度。 　　1．2．4　cDNA第1链的合成 cDNA第1链合成采用MBI Fermentas公司试剂盒，具体操作步骤参照使用说明书。 　　1．2．5　RT-PCR反应体系及程序 1)引物的选用与合成参照张开春等和张军科等的马哈利樱桃PGIP的序列合成一对引物，其上游引物为5-CGTTCACC CGCAATCACATlqCTTATCC-3：下游引物为5-TGG CCGTGGGAATTATTFGCAGC-3；引物由上海生物工程公司合成。2)PCR反应体系为20μL反应体系：10×PCR Buffer(plus)2.0μL，dNTP(10mmoL/L)0.3μL，MgCl2(25mmoL/L)0.3μL，TAQ(2.5μ/L)0.5μL，cDNA 1.0μL或cDNA25.0ng，上游引物(10μm/mL)0.6μL，下游引物(10μm/mL)0.6μL，ddH2O 14.7μL。扩增程序为：预变性95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 1min；72℃ 1min循环35次；72℃10min；4℃保存。3)电泳检测：同RNA电泳检测过程。 　　1．2．6　目的片段回收与克隆 PCR产物经1％琼脂糖电泳分析后，用玻璃奶法回收片段(操作步骤见北京原平皓公司产品说明书)，以pGEM-T-Easy为克隆载体，16℃连接过夜，后转化DH5a感受态细胞，在加Amp的选择性培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌并做菌液PCR，进行初步鉴定后测序。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1　总RNA的提取 　　取2μL在紫外分光光度计上测其含量，得结原如下：D230nm=0.110，D260nm=