短命植物小拟南芥全长cDNA文库的构建、测序及EST分析-遗传学专业论文.docx

 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果 .据我所 知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果. 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意. 研究生签名:熬示喔 时问 : ?/于， 年 b 月主日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向 国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版.有权将学位论文在学校图书馆保存并 允许被查阅.有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务.有权将学位论 文的标题和摘要汇编出版.保密的学位论文在解密后适用本规定. 最 、东 熬 名 签 生 究 研 时间: ]AJI于年 b 月主日 dMU Z， 乡山 名 签 师 导 时间:t1J /(j) 年 b 月 万方数据 摘要 小拟南芥(Olimarabidopsis pumila)属十字花科无苞芥属(Olimarbidopsis)，现在接受名为 无苞芥，其花为黄色，果实被毛，其与模式植物拟南芥的亲缘关系较近，但比拟南芥具有更 强的耐盐能力，广泛分布在新疆半干旱和半盐碱化的土地上。 目的：为了从小拟南芥中挖掘耐盐碱相关基因，采用 5′帽子抗体富集全长 cDNA、并利用 Gateway 技术构建了小拟南芥经 500 mmol/L NaCl 盐胁迫诱导的叶片均一化全长 cDNA 文 库，从而避免了基因被内切酶切断的风险。并对文库中克隆进行随机测序分析。本研究为耐 盐碱相关基因的挖掘、开展比较基因组学和基因组进化研究提供重要资源。 方法：利用 Gateway 技术及基因组饱和杂交技术构建了小拟南芥经 500 mmol/L NaCl 盐胁迫 诱导叶片的均一化全长初始和均一化 cDNA 文库。从均一化文库中随机挑选 1 151 个克隆进 行测序，对测序所获得的 EST 进行分析，包括去除载体序列和低质量序列，序列拼接和装 配， BLAST 比 对 分 析 ， 功 能 注 释 和 分 类 ， 以 及 信 号 通 路 分 析 。 利 用 半 定 量 RT-PCR (semi-quantitative RT-PCR)及实时荧光定量 PCR (quantitative Real-time RT-PCR, qRT-PCR)技 术分析 contigs 分??在高盐胁迫下的表达水平。利用 RT-PCR 方法和 5′-RACE 技术，克隆了 一个 Na+/H+逆向转运蛋白基因 OpNHX1，构建植物表达载体及酵母表达载体，分别采用花 滴法和乙酸锂转化法转化拟南芥和酵母突变体，分析转基因拟南芥的耐盐性以及对该基因进 行功能验证。利用 RT-PCR 方法克隆一个类钙调素蛋白基因 OpCML13 并利用 RT-PCR 方法 进行基因表达分析。 结果：(1) 经检测初始文库、均一化文库的滴度分别 1.6 × 106 cfu/mL 和 6.7 × 106 cfu/mL，重 组率约为 95%，插入片段平均大小大于 1 kb。 (2) 通过序列分析，共获得 894 条高质量表达序列标签(ESTs)，装配成 736 个 unigenes， 包括 72 个 contigs 和 664 个 singletons。比较分析表明 736 个唯一基因同拟南芥(Arabidopsis thanliana)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)和盐芥(Thellungiella salsuginea)有较高的相似性。 根据基因本体论 GO (Gene Ontology)将 736 个 unigenes 进行功能分类，涉及到广泛的生物学 过程。分析与逆境相关的 ESTs，发现了小拟南芥中存在更多的逆境胁迫相关基因。将 894 条 ESTs 全部提交到 GenBank 中(登录号：JZ151519~JZ152412)。 (3) 对均一化文库中丰度较高的 16 个 contigs 进行表达分析，以不同浓度 NaCl 处理 24 h 的小拟南芥叶片为材料，进行 RT-PCR，结果表明：contig 10、11、14 的表达量随着 NaCl 浓度升高而逐渐升高；用 200 mmol/L NaCl 处理不同时间后的小拟南芥叶片为材料，进行 RT-PCR，结果表明：contig 7、9、11、16 的表达量随着时间的增加而逐渐升高；用 100 μmol/L ABA 胁迫不同时间的小拟南芥叶片为材料，进行 qRT-PCR，结果表明：contig 1、5、9、15、 16 的表达量随着时间的增加而逐渐升高。 (4) 小拟南芥 OpNHX1 全长共 2 153 bp，最大开放阅读框(