毒莠定(PIC)调控百子莲愈伤组织胚性诱导与保持生理生化基础的研究-风景园林专业论文.docx

上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文《毒莠定（PIC）调控百子莲 愈伤组织胚性诱导与保持生理生化基础的研究》，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日  上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密□，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日  毒莠定调控百子莲愈伤组织胚性诱导与保持生理生化基础的 研究* 摘 要 外源生长素类物质毒莠定（ PIC ）能够有效地诱导百子莲 （Agapanthus praecox ssp. orientalis）外植体形成非胚性愈伤组织（No Embryogenic Culture, NEC）并发育成胚性愈伤组织（Embryogenic callus， EC），且在含有不同浓度 PIC 的培养基上继代培养的 EC 具有不同的胚 性保持能力。本文选取了‘蓝色大花’百子莲体细胞胚胎发生过程中 NEC、1.0 mg/L、1.5mg/L 和 2.0 mg/L PIC 继代的 EC 共 4 种样品对其 细胞形态学观察，并进行内源生长素（IAA）含量、物质能量代谢规 律、氧化胁迫与抗氧化系统、细胞程序性死亡（Programmed cell death， PCD）、DNA 甲基化水平等生理生化指标的分析研究，利用 qRT-PCR 技术对分离与鉴定的激素信号、细胞分裂与细胞周期过程、抗氧化系 统等 46 个关键基因进行定量分析，并对生理生化结果进行验证，旨在 研究 PIC 对百子莲体细胞胚性诱导与保持的生理生化基础，主要研究 结??如下： （1）形态学观察结果表明 NEC 细胞体积大而核小，细胞内淀粉 含量丰富；EC 呈现为黄色颗粒状或部分细胞已经成胚。NEC 的内源 IAA 含量最低，为 0.177 ng/g.FW；随着外源 PIC 浓度的升高，EC 中 内源 IAA 含量逐渐下降，且显著高于 NEC，分别为 NEC 的 14.2、10.5 与 4.0 倍，表明外源生长素与內源 IAA 信号之间存在竞争关系。高含 量的淀粉、可溶性蛋白分别在体细胞分化、胚性的启动与保持上起重 要作用。百子莲 NEC 与 EC 中共检测到 10 种脂肪酸，其中饱和脂肪 酸和不饱和脂肪酸各 5 种；1.5mg/L PIC 浓度下 EC 中油酸，硬脂酸， 山嵛酸与木蜡酸的百分含量分别为显著高于 NEC，而表征脂肪酸双键 I  指数（Double-bind index，DBI）明显低于 NEC，意味着胚性能力的保 持需要的脂肪酸含量高且脂肪酸双键指数低。 （2）3 种抗氧化酶 SOD、POD 和 CAT 和 ROS 组分（O2·-、OH·和 H2O2）在百子莲胚性能力获得和维持中相互制约，维持细胞内活性氧 的平衡，进而促进体细胞胚性的获得及保持。O2·-、OH·和 H2O2 的积 累和扩散启动 PCD，清除多余的胚柄（supensor organism）、建立胚胎 极性，启动体胚发生。 （3）采用 MSAP（Methylation Sensitive Amplified Polymorphism） 技术对百子莲 NEC、3 个浓度 PIC 继代的 EC 进行 DNA 甲基化水平研 究发现，在 NEC 转化为 EC 的过程中总甲基化率降低了约 2 个百分点， 而随着外源 PIC 浓度的升高或降低，EC 中碱基序列的变化比更为频繁， 总甲基化率升高了 6-14 个百分点， DNA 甲基化率维持在 26%以下是 体胚发生过程中必不可少的，调控 EC 有更多的基因处于活跃的转录 状态，从而维持其胚性能力。 （4）利用 qRT-PCR 对百子莲 NEC 与不同浓度 PIC（1.0，1.5，2.0 mg/L）继代的 EC 进行激素信号、细胞分裂与细胞周期过程、抗氧化 系统等 46 个关键基因的表达定量分析，结果表明生长素信号与乙烯信 号增强，染色质结构与表观遗传修饰调控作用明显增强，细胞壁结构 与附属结构发生重要的变化，物质能量代谢、次生代谢及能量运输过 程减弱。在体细胞胚性