冬虫夏草无性型原生质体制备及种群遗传多样性研究-微生物学专业论文.docxVIP

摘 要 冬虫夏草是我国传统的、珍贵的中草药。目前，野生冬虫夏草产量急剧下降， 而价格飞涨。为改变现状，人工培育冬虫夏草成为研究热点。了解冬虫夏草菌种的遗 传多样性以及开展原生质体融合（Protoplast fusion）育种，将为实现上述目标提供研 究基础和前提。本文应用不同的分离方法以及分离不同部位的组织获得了数十株冬虫 夏草无性型中国被毛孢菌株，研究其原生质体制备的最佳工艺；同时，采用 ISSR 分 子技术和交配型基因 mat1-2-1 获得了冬虫夏草种内的相关遗传多样性信息。通过研 究获得以下结果。 以冬虫夏草无性型中国被毛孢为原材料，通过液体培养获得菌丝体，经酶解处理 后在不同条件下获得原生质体，以研究酶的种类及浓度、渗透压稳定种类及浓度、酶 液 pH 值以及酶解时间的不同，对中国被毛孢原生质体制备的影响。结果显示中国被 毛孢菌株原生质体的最佳制备条件为：使用浓度配比分别为 4mg/ml 和 3mg/ml 的 Yatalase 和 Glucanex 酶，在 1.0MKCl 作为渗透压稳定剂，酶液 pH 值为 6 时，酶解 3h，所得的原生质体量最多。 从60个引物中筛选出7个扩增条带清晰且多态性好的ISSR引物，并摸索合适的 PCR反应条件，用于40株菌株的PCR反应。共得到62条带，其中多态性条带38条，多 态性百分率仅为63.15%，遗传相似系数范围在0.78~1.00之间。进行UPGMA法聚类分 析，得出：40株中国被毛孢菌株并没有完全按照不同的分离方法聚为3个类型。单子 囊孢子分离法获得的菌株，区别于其它菌株而单独聚为一类，其它分离法获得的菌株 混合聚类。可见，单子囊孢子菌株的ISSR指纹图谱与其它菌株有较明显差异。总的看 来，同一地区的中国被毛孢各菌株间具有一定的遗传多样性，但遗传差异不是太大。 参照 Zhang 等的交配型基因 mat1-2-1 的扩增引物，对本实验分离获得的 40 株菌 株进行 PCR 特异扩增。取其中 7 个拼接好的 MAT1-2-1 区碱基序列，与来自 GenBank 数据在内的共 11 个样品构建系统发育树，发现本实验采自青海的 7 个供试菌株，连 同 GenBank 中来自青海的菌株（FJ654176）共同组成了一大类群，其 bootstrap 值为 96%；而 GenBank 中其他地区的菌株聚成另外的类群。mat1-2-1 基因序列对于不同地 区的菌株遗传多样性有一定的???分度，但未能有效的区分同一地区菌株间的遗传多样 性。本实验分离得到的 10 株单子囊孢子菌株全部含有 mat1-2-1 基因，可以看出冬虫 夏草的 mat1-1:mat1-2 不是按 4:4 进行分离，因此冬虫夏草可能不是异宗配型，极有 可能是同宗配型。 关键词：冬虫夏草，原生质体，ISSR，遗传多样性，mat1-2-1基因  Abstract Ophiocordyceps sinensis is a precious and traditional Chinese herbal medicine. At present, the production of the O. sinensis declines sharply, and the price soars. To change the status quo, artificial culture of O. sinensis has become a focus of study. To study the genetic diversity of O. sinensis and to carry out protoplast fusion breeding will provide the basis and the premise for reaching these goals. In this paper , We obtained the dozens of the anamorphic isolates of O. sinensis by different isolation methods and by separation from different parts of tissue. We should study the optimum conditions for protoplast preparation of these isolates and use the ISSR molecular technology and the mating type gene mat1-2-1 to obtain information about the genetic diversity within species of