第3章 蛋白质的分离课件.ppt

Hubei University * 用PAG电泳分离的大分子的检测 1．考马斯亮蓝染色法 2．银染色法 3．荧光染色技术 4．酶活性染色法 5．同位素检测法 6．用荧光标记的抗体检测 回上页 Hubei University * 考马斯亮蓝染色法 灵敏度高，检出极限为0.3～lug 用磺基水杨酸将蛋白质固定在PAG上 用 0.25％考马斯亮蓝染料液染色2～4／小时 过量染料用7％醋酸洗涤除去 脱色液由冰醋酸、甲醇和水组成，反复洗涤即可脱色 凝胶可保存在7％醋酸中。 回上一级 Hubei University * 银染色法 利用银离子与蛋白质以盐或配位络合盐的形式结合，后由甲醛将银离子还原成可见的银颗粒 可检测ng级的蛋白质 操作简便、快速、不需特殊设备和试剂，可与同位素放射自显影相媲美 回上一级 Hubei University * 荧光染色技术 用于PAG上蛋白的检测，灵敏快速。 苯胺基萘磺酸镁（ANS）在水中不发荧光，在有机溶剂中或结合到蛋白的疏水表面，会发出强烈荧光。 蛋白质变性后再染色，检出极限ng级。 回上一级 Hubei University * 酶活性染色法 利用酶的催化专一性反应进行染色，分 ①酶的底物或产物有荧光，反应后，可检测荧光的消失和出现。 ②酶催化产生颜色很深的不溶性产物，能指示该酶在凝胶上的位置。 回上一级 Hubei University * 同位素检测法 具有放射性的配体与凝胶上的蛋白质专一结合后，可用放射自显影法检测结合的配体。 回上一级 Hubei University * 用荧光标记的抗体检测 用荧光素标记抗体，抗体进入凝胶后与待检蛋白结合，洗去未结合的抗体后，经紫外光照射，即可检出荧光的位置。 回上一级 Hubei University * ◆包括有免疫电泳、火箭免疫电泳、交叉免疫电泳、薄层凝胶过滤免疫电泳、电聚焦交叉免疫电泳、火箭线形免疫电泳、交叉线形免疫电泳等。 1953年由 Grabar及Williams两人发明，后来改成一种微量测定法 三、凝胶免疫电泳 用琼脂糖作介质的电泳分离和专一性免疫沉淀反应相结合的检测方法称为凝胶免疫电泳（gel immunoelectrophoresis）。 回第五节 Hubei University * 火箭免疫电泳 抗体预先混入凝胶中，选择适当的pH使抗体分子不泳动。 抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。 随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。 抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比。 Hubei University * 一般情况下，抗原检出灵敏度在 0.3mg／L左右。 火箭电泳示意图 Hubei University * 四、高效毛细管电泳 回第五节 Hubei University * 毛细管电泳 ?1? 离子移动的速率 ? = ?eE = ?eU/L U是毛细管柱两端施加的电压? L是毛细管柱总长。 采用高电压可以达到使离子迅速移动和快速分离。 ?2? 毛细管电泳中的塔板数较高 由于分离度随塔板数的增加而增加，因此为了获得高的分离度应采用高电压。 在凝胶板电泳中，一般最高使用的电压约为500 V。 在毛细管电泳中，一般可采用20,000 ~ 60,000 V的高电压。 毛细管电泳的基本原理 Hubei University * ?3? 洗脱 在典型的毛细管电泳分离中，离子的洗脱顺序是: 首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。 Hubei University * 毛细管电泳装置 一般在一根长 40 ~ 100 cm, 内径 10 ~ 100 ?m 的毛细管柱中充入缓冲溶液，柱的两端置于两个缓冲池中。在两个缓冲池之间的毛细管接有两个铂电极。试样从一端进入，而检测器则在另一端。使用的高电压可以反相，以能分析阴离子。 Hubei University * 一般的进样方式是电动进样和压力进样。 电动进样是将毛细管柱的一端放入样品杯中，施加瞬时电压，使试样进入毛细管柱。 压力进样外加压力使试样溶液进入毛细管。如在检测器端抽真空，或提高加样端液面。 Hubei University * 毛细管电泳的分离模式与应用 细管区带电泳 ?capillary zone electrophoresis, CZE? 毛细管凝胶电泳 ?capillary gel electrophoresis, CGE? 毛细