第三章 酶的发酵生产课件.ppt

第三章 酶的发酵生产; 发酵是指在应用微生物工业中，所有对微生物或动物、植物细胞的培养。 酶的发酵生产是指经过人工控制，利用微生物或动物、植物细胞的生命活动，生产酶的过程。 酶的发酵根据所用的产酶细胞不同，可分为微生物发酵产酶、植物细胞发酵产酶、动物细胞发酵产酶；也可以根据细胞培养方式不同，分为固体培养、液体深层发酵、固定化细胞发酵。;第一节 酶动力学 一、单底物动力学 k3在单底物酶促反应中，底物（S）首先与酶（E）结合，生成底物和酶的复合物（ES），然后复合物分解，形成产物（P）并释放出酶，这个过程可表示如下： ; 对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速度与底物浓度[S]无关。 ; 米彻利斯（Michaelis）和曼吞（Menten）在前人工作的基础上，通过大量的定量研究，提出了酶促动力学基本原理，并推导出了著名的米-曼氏方程，推导过程如下： 根据上述反应式，中间产物ES的生成速度(底物S的消失速度) v1＝k1[S][E]－k2[ES] （2-1） 而ES的消失速度(产物P的生成速度) v2＝k3 [ES]，当反应达到平衡时，即v1＝v2时 k1[S][E]－k2[ES]= k3 [ES] （2-2） 整理后得 ; 当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则[E]t=[ES]。此时反应速度达到最大Vmax，即 Vmax= k3 [ES]= k3[E]t （2-8） （2-7）除以（2-8），并整理得 ; 这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = 1／2Vmax时，米氏方程可转化为下式： 整理上式可得 Km= [S]; 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：; 对于很多酶而言，上式中的k2比k3大得多，此时的Km的值依赖于酶与底物的复合物ES生成和解离的速度常数k1和k2的相关值。高的Km表示弱的底物结合（k2远远大于k1），低的Km表示强的底物结合（k1远远大于k2）。 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度呈双曲线关系，不易直接求出Vmax和Km的值，通常采用双倒数法进行参数估计。将米氏方程改写成以下形式 ; 二、多底物动力学 通常情况下，酶催化反应涉及两个(少数情况下三个)底物。现在我们考虑一个涉及两种底物和两种产物的酶促反应，其反应通式如下: A＋B→ P＋Q ; 1、有序反应机理(ordered reaction) 这种情况下，A和B分别可被说成是先导底物和后随底物，Q是A的产物，最后被释放。A和Q竞争同游离酶E结合，但A和B则不会（或者Q和B也不会）发生竞争（如图）。依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋或NADP＋）的脱氢酶的反应就属于这种类型。; 2、随机反应机理（random reaction） 这种类型中，A和B两个底物无论哪个先同酶结合都没关系；同样地，产物P和Q谁先释放也不重要（如图）。某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。 ; 3、乒乓反应机理（ping pong reaction） 在乒乓催化反应中，第一个底物A(相当于P-X)的功能基团(X)被酶从底物上置换，产生第一个产物P和一个稳定的酶形式F(相当于E-X)，在F中，X是紧密地(往往共价地)同酶结合；在反应的第二阶段，X被第二种底物B从酶分子上取代，生成第二个产物Q(B-X)，酶也恢复到最初的形式（如图）。需要注意的是，在乒乓反应中，底物A和B并不彼此在酶分子上相遇。包括转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制。 ; 酶在催化反应中不能改变反应的平衡，但可以加快反应速度。要想在实际生产中最有效地利用好酶，让其发挥最大的作用，达到比较小的成本，同时能生产出同样价值量的产品，必须对影响酶促反应的主要因素