发酵工程技术第二章 工业发酵菌种选育.ppt

(三)淘汰已衰退的个体 通过物理、化学的方法处理菌体(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。 三、菌种保藏 目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用。 基本原则： 1、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温） 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株 ①低温保藏法方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。②石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。 ③干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。 ④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。 End Thanks! * * * * * * * * * * * 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 采样（造纸厂） →80度30分钟处理 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 从285个土样中获得62株 26株为组成型 36株为诱导型 ↓ （４）生产性能的测定 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。 这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株。 （5）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 （二）诱变育种 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率很低，一个基因的自然突变频率仅10-6～10-10左右。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 　诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂 物理：紫外线，快中子，X射线，γ射线，激光 化学：碱基类似物、与碱基反应的物质 生物诱变剂 { 确定出发菌株 ↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓ 制备单细胞（或单孢子）悬液 ↓←活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 ↓ 诱变处理 ↓ 平板分离 ↓计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 ↓ 突变体的初步筛选 ↓←用简单快捷的方法 重复筛选 ↓←摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理） 二、微生物的诱变育种 出发菌株的选择 1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2．在生产中的菌株因经多次诱变，应考虑新的诱变方法。 3. 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞， 处理菌悬液的制备 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。 诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。 分离和筛选 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上形成的透明圈或抑菌圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。 紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 例 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 (二)