玉米纹枯病病菌y―谷氨酰转肽酶基因克隆和表达分析.docVIP

玉米纹枯病病菌y―谷氨酰转肽酶基因克隆和表达分析 　　摘要：前期利用In-Fusion SMARTerTM cDNA Library-Construction Kit已完成玉米纹枯病菌WF-9菌株的全长cDNA文库，并进行EST分析。笔者在此基础上，将EST片段进行聚类拼接，得到一个长944 bp的序列，根据所得序列开放阅读框设计引物，克隆得到玉米纹枯病病菌y-谷氨酰转肽酶基因（GGT）cDNA序列，以生物信息学方法对其序列进行预测分析，并利用real-time PCR分析GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片不同时期的表达特性。结果表明，克隆所得617bp序列与EST序列完全相同，在GenBank进行Blastx同源比对，与gamma―glutamyhranspeptidase（Rhizoctoniasolani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。实时荧光定量PCR表明，GGT在立枯丝核菌侵染玉米叶片各个时期均有表达，并存在明显差异，其中在病菌侵染玉米叶片24 h时表达量最高。 　　关键词：立枯丝核菌；GGT；基因克隆；表达分析 　　中图分类号：S435.131.4+9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0039-03 　　玉米纹枯病是世界玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一。近年来，随着玉米栽培密度的提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米纹枯病发生的小气候条件，该病在某些地区危害日益严重，有逐年加重的趋势。玉米纹枯病现已成为制约我国玉米持续增产的主要病害。 　　目前，关于真菌病害相关基因研究较多，杜欣可克隆了玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶的基因，用该基因构建了酵母工程菌株，接种玉米叶片出现水浸状病斑。崔福浩成功克隆了β-1，4-内切纤维素酶基因，用该基因构建了酵母工程菌株，接种试验表明，该基因可以杀死植物细胞。还有一些与代谢有关的基因已被克隆，Bowyer等发现引起禾谷类全蚀病的禾顶囊壳菌（Gaeuman-nomyces gramins）产生燕麦素酶分解燕麦根表皮细胞内的皂角苷燕麦素，编码该酶的基因突变后禾顶囊壳菌也就失去了对燕麦的致病力。关于玉米纹枯病菌y-谷氨酰转肽酶基因（Gamma一对utamyltranspeptida-se，GGT）未见报道，y-谷氨酰转肽酶是一种催化肽基转移作用的酶，在H pylori诱导的线粒体介导的程序性细胞死亡中，主要是通过诱导线粒体释放细胞色素c进入细胞质和激活Caspase家族成员起作用，H pylori y-谷氨酰转肽酶（y―glutamyl transpeptidase，GGT）在分泌和成熟后通过离子键与细胞膜结合，将细菌和宿主细胞直接连接起来。y-谷氨酰转肽酶广泛存在于原核和真核细胞中，在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器，在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要作用。 　　笔者所在实验室构建了立枯丝核菌cDNA文库，获得了329个高质量ESTs序列。为了明确GGT在病菌侵染过程中的表达情况，通过对EST数据进行分析，根据所得序列设计引物，克隆了立枯丝核菌GGT，验证了前期EST序列测序结果。在此基础上，通过测定该基因在病原菌侵染过程中的表达量，探明该病原菌与寄主互作过程中的基因表达规律，为下一步研究侵染机制奠定基础。 　　1.材料与方法 　　1.1材料 　　玉米立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG-IlA）菌株WF-9，沈阳农业大学植物免疫研究所保存。立枯丝核菌在PDA培养基培养3d，刮取菌丝50～100mg，用于RNA提取、克隆。用离体叶片接种法，将培养3d的立枯丝核菌菌饼，放在玉米3叶1心期苗的叶片上进行接菌，分别取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片（水渍状发病处）100mg，用于各个侵染时期基因表达量分析。所有样品经液氮速冻，保存于-80℃备用。 　　1.2 RNA提取及cDNA第一链的合成 　　提取菌株WF-9生长第3天样品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米叶片总RNA，参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度计测定浓度，使用TaKaRa公司反转录试剂盒合成cDNA第一链。 　　1.3立枯丝核菌GGT的克隆 　　笔者所在实验室已经构建了玉米立枯丝核菌AG-1-IA的全长cDNA文库，并进行了全长cDNA的随机测序。在随机测序中，分离出GGT EST片段，通过软件拼接，得到长944 bp的基因，包含完整开放阅读框。本试验根据所得序列开放阅读框，利用软件primer premier 5.0设计特异性引物c06-f：5-CACGCATACTCCCGACT