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雾灵鼻通喷雾剂微生物限度检查方法建立和验证 摘　要：目的: 建立并验证雾灵鼻通喷雾剂的微生物限度检查方法 方法: 采用薄膜过滤法检查雾灵鼻通喷雾剂的微生物限度，并依据《中国药典》2010年版收载的方法进行验证。结果 :5种菌株的回收率均高于70% ,且控制菌检查具有专属性。结论 :采用薄膜过滤法检查雾灵鼻通喷雾剂微生物限度可行。 　　关键词：雾灵鼻通喷雾剂　微生物限度检查　薄膜过滤法 　　雾灵鼻通喷雾剂为我院非标准制剂，具有抗菌消炎、收缩血管的作用，用于治疗过敏性鼻炎、鼻窦炎、鼻黏膜肿胀，疗效显著。为加强制剂质量控制,根据《中国药典》（2010年版）微生物限度检查法要求,结合雾灵鼻通喷雾剂含有抑菌成分的特点,本实验建立并验证了供试品经薄膜过滤法处理后的微生物限度检查方法,为规范本品的微生物限度检查提供科学理论依据。 　　1仪器与材料 　　1.1仪器 　　双层立式电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；HTY-100型微生物限度检验仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）；S60型微生物限度培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司，孔径0.45μm，滤膜直径50mm）；垂直层流洁净工作台(CA-920-2，上海上净净化设备有限公司)；垂直层流洁净工作台（HFsafe-1200，上海力申科学仪器有限公司）；OLYMPUS-BX51型双目显微镜；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）等。 　　1.2培养基及稀释液 　　营养琼脂培养基（批号：1005216）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号：1004222），改良马丁液体培养基（批号：090330）；甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：100111）；十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基（批号：1002221）；氯化钠蛋白胨缓冲液（批号：1002021）；以上试剂均购自北京陆桥技术有限责任公司；营养肉汤培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号；二盐酸二甲基对苯二胺（天津市光复精细化工研究所）；0.9%氯化钠注射液(NS)（四川科伦药业股份有限公司，批号：110509,100mL/瓶）等。 　　1.3菌种 　　大肠埃希菌[CMCC(B)44102] 、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501] 、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001] 、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]，以上菌株均由中国食品药品检定研究院提供，传代次数不超过5代。 　　1.4样品 雾灵鼻通喷雾剂（第三军医大学野战外科研究所大坪医院药剂科，批号为：110329A,110601A,110811A） 　　2实验方法[1-4] 　　2.1供试液制备 取样品10mL,加pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL,制成1:10供试液，再取1:10供试液10mL，加pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL制成1:100供试液，作为试验用供试液，备用。 　　2.2菌液制备 　　取经35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1mL含菌落数为50～100 cfu?qmL-1的菌悬液；取经25℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1mL含菌落数为50～100 cfu?qmL-1的菌悬液；取经25℃培养5～7d的黑曲霉斜面培养物，加3～5mL0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1mL含菌落数为50～100cfu/ml的孢子悬液，备用。 　　2.3细菌、霉菌及酵母菌回收率试验 　　采用薄膜过滤计数法,按规定进行3次独立的平行试验,分别计算各试验菌的回收率。 　　2.3.1试验组 　　取1∶100供试液1mL,加入过滤器中,经薄膜过滤后,冲洗3次,每次100mL,在最后一次的冲洗液中各加入1mL的50～100 cfu?qmL-1大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌菌液或黑曲霉孢子悬液,过滤。取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基上,分别置30～35℃培养48h或23～28℃培养72h。每株试验菌平行制备2个平皿。按《中国药典》（2010年版）菌落计数方法计数。 　　2.3.2菌液组 　　测定所加的试验菌数。除不加供试液外,其余操作同试验组。 　　2.3.3 供试品对照组 　　测定供试品本底菌数,除不加菌液外,其余操作同试验组。 　　2.3.4稀释液对照组 　　测定稀释液是否干扰微生物生长。取稀释液1mL代替供试液,其余操作同试验组。 　　2.4回收率计算方法 　　稀释液对照组的加菌回收率(%)=(稀释液对照组平均菌落数/菌液组