萝卜抽薹相关SRAP分子标记筛选和分析.docVIP

萝卜抽薹相关SRAP分子标记筛选和分析 　　摘要：利用抽薹性状差异较大的晚抽薹萝卜品种L2和早抽薹萝卜品种E6配制杂交组合，构建F2群体。通过田间调查，选用极晚和极早抽薹单株分别构建晚抽池（BSA-1）和早抽池（BSA-2），用288对SRAP组合对两亲本进行PCR分析，共筛选出166对SRAP引物组合。通过2个基因池及基因池中各单株对筛选出的引物进行复筛，获得引物组合me3+em9，其在晚抽池中可扩增出多态性片段LB；对156株F2单株进行验证发现，LB与晚抽薹基因紧密连锁，其遗传距离为5.7 cM。 　　关键词：萝卜；晚抽薹；分子标记；遗传距离 　　中图分类号： Q943；S631.103文献标志码： 　　文章编号：1002-1302（2016）08-0074-03 　　抽薹开花是农业生产上的一个重要现象，不仅对植物生殖器官的形成起关键作用，而且关乎到植物的生物产量和产品品质。先期抽薹在十字花科作物栽培上是一个倍受关注的问题，不仅会降低十字花科作物的生物产量，而且会影响到产品的品质，晚抽薹是十字花科作物一??重要的育种目标[1]。生物技术的发展给作物遗传育种研究带来巨大变化，分子标记技术的应用是其中之一。分子标记具有位点丰富、多态性高、稳定可靠等特点，且检测不受时间和性状表达限制，可鉴别基因型的纯合或杂合。本研究利用与晚抽薹基因紧密连锁的分子标记可以方便准确识别不同晚抽薹基因的特点，通过群体分离分析法（BSA）筛选出与晚抽薹萝卜基因紧密连锁的分子标记，以实现分子标记辅助育种，减少萝卜选育过程中对表型性状的依赖，从而大大提高萝卜的育种效率。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　萝卜晚抽薹品种L2，为韩国白玉春萝卜第9代自交系；早抽薹品种E6，为短叶13萝卜第10代自交系，均由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。将晚抽薹与早抽薹亲本进行杂交再自交，形成F2分离世代群体共计156株单株。引物由上海英俊进行合成；dNTPs、TaqDNA聚合酶等分子生物学试剂，均购于TaKaRa公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1DNA提取与检测试验于2014年在江苏省农业科学院园艺研究所高效园艺作物遗传改良重点实验室进行，基因组DNA提取采用改良的CTAB法。采用DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪，缓冲液为1.2%TAE，琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时电压100 V（5 V/cm），时间为1 h。电泳结束，在 FR-200 紫外可见分析装置上检测、照相，记录结果。 　　1.2.2SRAP反应采用优化的SRAP反应体系，SRAP引物序列参考Li等信息[2-3]。PCR反应体系（10 μL）为：3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L上、下游引物，0.6 U TaqDNA聚合酶，20 ng模板DNA。PCR反应程序为94 ℃变性3 min；94 ℃ 60 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，5个循环；94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，33个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V预电泳30 min，160 V电泳2.5 h。凝胶中含有Arc ∶[KG-*3]Bis为29 ∶[KG-*3]1 6.65 mL，5×TBE 5 mL，TEMED 20 μL，10%AP 0.3 mL。1×TBE电泳缓冲液配方（1 L）为：0.054 g Tris，0027 5 g硼酸，0.25 mol/L EDTA 0.04 mL，pH值为8.0。电泳结束，采用0.5%冰醋酸、10%乙醇固定15～20 min，0.2% AgNO3溶液染色12～15 min；蒸馏水洗涤2次，于含1.5%NaOH、0.4%甲醛、0.002% Na2S2O3的显影液中显影，白炽灯箱下观察拍照。 　　1.2.3引物筛选利用萝卜晚抽薹品种代号L2和早抽薹品种E6的DNA为模板，从现有288对SRAP引物中筛选出双亲间存在多态性、条带清楚、易于识别、可以稳定扩增的引物；基于抽薹性状表现型，在F2群体中选取极早抽薹和极晚抽薹单株各10株，构建早抽池（BSA-1）及晚抽池（BSA-2），待幼苗长至5叶1心时提取DNA，等量混合；分别提取各单株基因组DNA，以早抽池、晚抽池及2个基因池中各单株 DNA 为模板，对筛选出的多态性引物进行再次筛选，寻找可能与目标基因连锁的标记；用获得的DNA标记对F2群体进行标记。PCR 产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。 　　1.3数据统计及连锁分析 　　用筛选到的具有多态性引物组合对待检测F2群体的DNA样品进行PCR扩增，统计有差异、易于识别的多态性条带，有带记为1，无带记为0。田间调查时，分别以1、0记录晚抽薹、