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乳酸细菌甘露醇脱氢酶的研究进展 　　摘 要　由于在医药、食品、化工行业中的需求不断增长,甘露醇的生产制备受到国内外的重视。乳酸细菌生产甘露醇具有反应选择性高、反应条件温和,甘露醇收率高等优点,是甘露醇生产研究的热点。乳酸细菌甘露醇脱氢酶是异型发酵乳酸细菌合成甘露醇的关键酶。本文综述了乳酸细菌甘露醇脱氢酶的研究概况,包括酶学特性、结构及分子生物学,并对其研究前景进行了展望。 　　关键词　甘露醇脱氢酶;甘露醇;乳酸细菌 　　中图分类号Q814　文献标识码A　文章编号1674―6708(2010)28-0104-02 　　 　　甘露醇(mannit01),又称D-甘露糖醇,分子式为C6H1406,与山梨醇为同分异构体。甘露醇广泛存在于自然界生物体中,在医药、食品、化工和轻工行业有着广泛的应用。在医药行业,甘露醇主要被作为注射液使用,用作片剂的赋形剂,降脑内压、眼内压的降压剂,利尿剂,抗肿瘤、降血脂、降胆固醇等药物。在食品中,可作为适于糖尿病患者食用的甜味剂。由于世界范围内食品行业尤其是口香糖对甘露醇需求量快速增加,甘露醇市场需求迅速增长。 　　甘露醇的制备方法有化学法和生物法。目前,在工业上制备甘露醇的方法是化学法,由于产率较低,且有大量副产物山梨醇的产生,给甘露醇的分离和纯化带来了困难。 　　甘露醇的生物法制备有海带提取法、酶转化法和微生物发酵法。海带提取法生产流程长,提取率低,污染严重,产品质量无法满足下游产品的要求,精制工艺麻烦,导致成本的增加,产品缺乏市场竞争力。酶转化法是利用甘露醇脱氢酶将果糖转化成甘露醇,由于反应中需要提供NADH或NADPH,这两者的价格昂贵,且产物对甘露醇脱氢酶具有强烈的抑制作用,因此从工业生产来看并不合适。微生物发酵法中可利用酵母或乳酸细菌来生产甘露醇。乳酸细菌生产甘露醇,具有明显的优点:甘露醇为主要产物,同时产乳酸、乙酸、乙酸和二氧化碳,不产山梨醇,易于纯化分离及精制,并且条件温和,转化率高。因此乳酸细菌发酵法制备甘露醇具有极大的发展潜力。 　　甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase)是异型发酵乳酸细菌中合成甘露醇的唯一酶,一种依赖于NADH(EC 1.1.1.67),另一种依赖于NADPH(Ec 1.1.1.138),催化果糖与甘露醇的相互转化: 　　果糖+NAD(P)H+H→甘露醇+NAD(P) 　　同型发酵乳酸细菌也可产生少量的甘露醇,但并非由甘露醇脱氢酶催化,而是由甘露醇1-磷酸酶将甘露醇-1-磷酸转化成甘露醇;此外,同型发酵乳酸细菌普遍可利用甘露醇作为碳源。异型发酵乳酸细菌的甘露醇产量高于同型发酵乳酸细菌,因此应用前者生产甘露醇的研究报道最多。 　　 　　1　乳酸细菌甘露醇脱氢酶的作用 　　 　　甘露醇脱氢酶只在异型发酵乳酸细菌中发现,这些细菌缺乏1,6一二磷酸果糖酶。通过6一磷酸葡萄糖酸/磷酸酮酶发酵六碳糖(如图1)。在厌氧条件下葡萄糖转化成乳酸、乙醇和二氧化碳,每摩尔葡萄糖发酵净产生一摩尔ATP。如果乙酰磷酸转化成乙酸,则额外产生一个ATP分子。此时NAD+的再生需要一个电子受体。果糖作为甘露醇脱氢酶催化反应的电子受体,转化成甘露醇。 　　 　　2　乳酸细菌甘露醇脱氢酶的性质 　　 　　在异型发酵乳酸细菌中,已有几个菌种的甘露醇脱氢酶被纯化。它们分别属于Leuconostoc和LactobaciHus两个属。 　　Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291的甘露醇脱氢酶分子量为155kDa,亚基分子量为43kDa,因此推测其由四个相同的亚基组成。依赖于NADPH,以NADH作辅酶时活力下降为32%。基因含1 017bp,氨基酸序列比对显示该酶属于含锌的中等长度链醇脱氢酶,还原酶家族。Leuconostoe mesenteroides ATCC 9135的甘露醇脱氢酶分子量为137kDa,包含4个相同的38kDa的亚基,还原果糖的最佳反应PH为5.35,米氏常数为0.035M,氧化甘露醇的最佳反应PH为8.6,米氏常数为0.020M。该酶的基因mdh含1014bp,酶的活性特异依赖于NAD。 　　 　　Lactobacinus intermedius NRRL B-3693的甘露醇脱氢酶等电点为PH 4.7,还原果糖的最佳反应温度为35℃,50℃下活力下降为44%,60℃时活力下降为15%,最佳反应PH为5.5,PH6.5时活力下降一半,PH 3.5时活力下降为35%。氧化甘露醇的最佳反应PH为7.0。纯酶在PH 4.5-8.0之间保持稳定,温度在低于35℃时保持稳定。以NADPH作辅酶时的活力比以NADH作辅酶要高4.27倍,因此是NADPH依赖型的甘露醇脱氢酶。Lactobac