嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ―1角蛋白酶底物特性及酶活测定的方法的研究.docVIP

嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ―1角蛋白酶底物特性及酶活测定的方法的研究 　　摘要：从羽毛加工厂污泥中分离到一株嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia ）YHYJ-1，对羽毛、羊毛和毛发底物均具有降解作用。菌株YHYJ-1对不同底物的降解能力存在差异，培养36 h羽毛完全降解，羊毛降解时间是72 h，毛发则在84 h有部分降解作用。分别以可溶性羽毛角蛋白、羽毛粉和偶氮角蛋白为底物进行酶活测定，以最高酶活值设定为100%，3种底物的相对酶活分别为100%、651%和232%，表明菌株YHYJ-1角蛋白酶的最适底物为可溶性角蛋白。菌株YHYJ-1接种于羽毛粉培养基， 培养20 h后角蛋白酶活性急剧升高，28 h酶活达最大值，之后快速下降。 　　关键词：嗜麦芽窄食单胞菌；羽毛；角蛋白质；角蛋白酶 　　中图分类号：Q9399文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0096-04 　　角蛋白质是广泛存在于羽毛、毛发、鳞片、蹄、角等组织中的硬性蛋白，是一类具有巨大潜在应用价值的废弃蛋白质资源。角蛋白含有大量高度交联的二硫键结构，不易被一般的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解[1]，限制了其应用。角蛋白分为α-角蛋白和β-角蛋白两种。α-角蛋白是毛发的主要构成组分，β-角蛋白多见于羽毛中[2]。角蛋白可被微生物分泌的角蛋白酶降解。不同种类微生物产生的角蛋白酶性能存在差异，特别表现于底物特性不同。角蛋白酶底物特性是研究微生物降解角蛋白质降解机理的基础。 　　角蛋白不溶于水及大部分有机溶剂，其活性测定比一般蛋白酶困难。目前测定角蛋白酶的方法主要有3种，一是直接用角蛋白粉（羽毛粉）作为底物[3]；二是使用经过修饰的底物偶氮角蛋白[4]或天青角蛋白[5]；三是以可溶性羽毛角蛋白作为底物[6]。 　　本实验室从羽毛加工厂污泥中分离到一株高效降解角蛋白质的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1，并研究了该菌株YHYJ?1的底物特异性，筛选出了最佳酶活测定方法，测定了菌株产角蛋白酶变化曲线，为深入研究其降解角蛋白质的机理提供了依据。 　　1材料与方法 　　11供试菌株与材料 　　嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） YHYJ-1，山东省农业科学院高新技术研究中心微生物实验室保存。 　　羽毛及羽毛粉：从肉鸡屠宰厂取鸡毛，洗涤剂漂洗，自来水冲洗后121℃高压灭菌25 min，再用蒸馏水充分洗净，80℃烘干。羽毛球磨粉碎过100目筛即羽毛粉。 　　羊毛与毛发：羊毛来自山东省农业科学院肉羊养殖厂，毛发来自理发店。自来水清洗，烘至恒重。 　　羽毛/羊毛/毛发培养基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛/羊毛/毛发5 g。 　　羽毛粉培养基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛粉10 g。 　　12角蛋白酶底物特异性 　　在羽毛、羊毛和毛发培养基上接种1%的YHYJ-1菌株培养液，37℃、180 r/min培养，观察YHYJ-1菌株对3种底物的降解情况。 　　菌株发酵液蛋白含量测定：采用Bradford（1976）[7]的方法进行蛋白质浓度测定，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。菌株YHYJ-1接种于羽毛、羊毛及毛发培养基中，每12 h取样1次，测定蛋白质含量。 　　13角蛋白酶活性测定方法 　　角蛋白粗酶液的制备：以1%的接种量接种于羽毛粉培养基，37℃、180 r/min培养24 h。4℃、12 000 r/min离心10 min，上清即为角蛋白粗酶液。 　　可溶性角蛋白、羽毛粉为底物的酶活测定方法参照Vermelho（2010）[8]的方法并加以改进：300 μl酶液加300 μl 06%可溶性角蛋白（羽毛粉）底物，50℃水浴反应30 min后加入300 μl 04 mol/L TCA终止反应。并以10 000 r/min离心10 min，于280 nm处测定吸光度。空白实验条件同实验组，在加角蛋白粗酶液前加300 μl 04 mol/L TCA提前终止反应。酶活性单位（U）定义为：混合液反应30 min后在280 nm的OD值比对照升高001定义为1 U。 　　偶氮角蛋白为底物的酶活测定方法参照Lin （1992）[4]的方法。酶活性单位（U）定义为：混合液反应30 min后在595 nm的OD值比对照升高001定义为1 U。 　　可溶性角蛋白的制备参照Wawrzkiewicz（1987）[6]的方法略有改动：剪去羽毛羽轴，加入甲醇