草鱼3个Toll样受体基因克隆和表达及与细菌性败血症关联分析-水产养殖专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所 写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以 将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 □ ,在 年解密后适用本版权书。 不保密 □ 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 上海海 上海海洋大学硕士学位论文 草鱼 3 个 Toll 样受体基因克隆和表达 及与细菌性败血症关联分析 摘 要 草鱼是我国重要的养殖鱼类，但是病害频发给草鱼养殖带来很大的经济损失。 研究草鱼免疫基因，培育抗病力强的草鱼新品种是一条有效的途径。Toll 样受体 （TLRs）是固有性免疫系统中的细胞跨膜受体及病原模式识别受体之一，它主要 通过识别病原相关分子模式（PAMPs）来启动免疫反应。本研究克隆获得草鱼受 体 TLR21、TLR20 和 TR18 基因，分析其序列，并采用草鱼呼肠孤病毒和嗜水气单 胞菌对草鱼进行诱导，研究这些基因在草鱼不同组织及其受病毒（GCRV）和细菌 诱导感染后的表达情况，进行不同基因型与草鱼细菌性败血症的关联分析，取得 了如下结果： 1. 根据斑马鱼的 TLR21 基因 cDNA 保守序列设计引物，通过同源克隆技术获 得草鱼 TLR21 基因的部分 cDNA 片段，采用 RACE 技术获得草鱼 TLR21 基因的 cDNA 全长序列 3578bp，其中开放阅读框（ORF）2958 bp，编码 985 个氨基酸， 含有 24 个氨基酸的信号肽。经 SMART 软件分析，该受体包含 17 个富亮氨酸区 （LRRs）、一个跨膜区和一个 TIR 保守区。Blast 分析发现，草鱼 TLR21 氨基酸序 列与斑马鱼的相似度最高，达到 79%。实时荧光定量 PCR 结果显示：草鱼 TLR21 基因在所检测的 12 个组织中均有表达，其中以皮肤、脾脏和肠组织表达量最高， 在肌肉、中肾和心脏组织表达量较低；经 GCRV 诱导后，草鱼 TLR21 基因在肝脏 和脾脏组织的表达量显著下调，而经嗜水气单胞菌诱导后该基因在肝脏和脾脏组 织的表达量显著上调。 2. 根据斑马鱼的 TLR20 基因 cDNA 保守序列设计引物，通过同源克隆技术获 得草鱼 TLR20 基因的部分 cDNA 片段，采用 RACE 技术获得草鱼 TLR20 基因的 cDNA 全长序列 3197 bp，其中 ORF 长 2835 bp，编码 944 个氨基酸，含有 19 个氨 基酸的信号肽。经 SMART 软件分析，该受体包含 6 个 LRRs、一个跨膜区和一个 TIR 保守区。Blast 分析发现，草鱼 TLR20 氨基酸序列与鲤鱼的相似度最高，达到 78%。荧光定量 PCR 结果显示，该基因在所检测的 10 个组织中均有表达，其中以 脾脏、头肾和肝脏组织表达水平较高，在中肾和心脏组织表达量较低；经 GCRV I 诱导后， TLR20 基因在肝脏组织显著下调，在脾脏组织 4h 显著下调然后表现出 高表达的水平，在鳃和肾脏组织表达水平均较高；TLR20 基因经嗜水气单胞菌诱 导后在肝脏组织 4h 表达水平迅速上调然后迅速下调，在脾脏组织 3 天内逐渐上升 然后在第 7 天受到显著抑制，在鳃和肾脏组织表达水平较高。 3. 从本实验室转录组序列获得草鱼 TLR18 基因的部分 cDNA 片段，采用 RACE 技术获得该基因 cDNA 全长序列 3600 bp，其中 ORF 长 2559 bp，共编码 852 个氨 基酸，含有 22 个氨基酸信号肽。经 SMART 软件分析，该受体包含 7 个 LRRs、 一个跨膜区和一个 TIR 保守区。草鱼与斑马鱼的 TLR18 氨基酸序列相似度最高， 高达 85%。荧光定量 PCR 结果显示，该基因在所检测的 9 个组织中均有表达，其 中以脾脏、鳃和心脏组织表达量较高，在肝脏、皮肤和脑组织表达量较低。经 GCRV 诱导后，TLR18 基因在肝脏组织 4h 显著上调然后受到显著抑制，在脾脏组织 3 天 表达水平显著上调然后第 7 天表达水平显著下调；经嗜水气单胞菌诱导后，该基 因在肝脏