茶树被茶尺蠖取食诱导的一个13-脂氧合酶基因的分离、功能鉴定与表达分析-茶学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 茉莉酸（JA）是植物对害虫取食诱导而产生直接防御的重要信号物质，而脂氧合 酶（LOX）是 JA 合成的关键酶之一，因此有关植物 LOX 研究备受关注，然而茶树 体内 LOX 的相关研究甚少。本论文以课题组前期获得一条被茶尺蠖取食诱导表达， 且可能为 LOX 基因的 EST（GenBank：GW342753）为基础，通过 cDNA 全长克隆、 原核表达、高效液相色谱、荧光定量 PCR 对茶树 LOX 的酶学特征和基因表达特征进 行研究。主要结果如下： （1）通过 cDNA 末端快速克隆(RACE)方法获得一条编码茶树 LOX 的全长 cDN A 序列，其开放阅读框长度为 2706 bp，编码 901 个氨基酸，并命名为 CsLOX3 （GenBank：HM440161），且其理论分子量和等电点分别为 101.84 kD 与 6.39；同源 比对分析结果发现 CsLOX3 与已经报道的茶树的 CsLOX2 同源性最高，为 80%；生 物信息学分析发现 CsLOX3 含有叶绿体转运肽，可能位于叶绿体，其保守功能区域有 3 个，且与 Fe3+结合的活性位点有 5 个氨基酸，分别是 His554，His559，His751，Asn755， Ile901。 （2）原核表达分析表明，重组后 CsLOX3 主要分布于此基因转化的大肠杆菌裂 解物上清中，SDS显示其分子量为 120 kD 左右。利用 Co2+-TALON Resin 树 脂进行蛋白质纯化，并对其进行相关酶学活性分析表明，CsLOX3 发挥酶活的最适温 度为 45 °C，此温度下酶活力为(24.6 mmol?min-1?mg-1) 最适 pH5.0，此 pH 下酶活力为 (22.57 mmol?min-1?mg-1)；通过 HPLC 分析发现，原核表达的 CsLOX3 酶促反应只生成 13-HPOT，因此属于 13S-LOX 类型。 （3）qRT-PCR 分析表明，CsLOX3 基因在茶树果实形成和开花初期表达量较低， 而在成熟期和盛花期表达量皆上升到最大，分别为初期的 16 倍与 15.3 倍；CsLOX3 基因在茶尺蠖取食后 6-24 h 一直处于上调表达状态，但是不同品种表达规律不尽相 同，上调表达的开始时间和最大表达量出现时间都是舒茶早品种较龙井 43 晚，但是 最大表达量相差不大，分别比对照高出 10 倍与 13.6 倍；机械损伤对其表达规律影响 与茶尺蠖取食相近，只是品种间差异较大，表现为舒茶早的 CsLOX3 基因最大表达量 要明显大于龙井 43，分别是各自对照的 10.6 倍与 3.6 倍；MeJA 处理龙井 43 后 2d， CsLOX3 基因表达量急剧升高至对照的 17.3 倍，至 4 d 后又急剧下降，而对舒茶早影 响不大，最大表达量仅是对照的 2.1 倍。 关键词： 茶树，茶尺蠖，脂氧合酶，基因克隆，功能鉴定 I II Abstract The jasmonic acid（JA）is important signal molecule fed by insects, lipoxygenase is the first key enzyme synthesised JA, so this enzyme is concerned for a long time, but the research of lipoxygenase is little in tea plant(Camellia Sinensis). This paper got a EST of LOX（GenBank：GW342753）, so we plan to use RACE, prokaryotic expression, HPLC, qRT-PCR to research the functional characterization and the gene expression pattern of LOX in tea leaves. （1）We obtained full-length cDNA of CsLOX3 by RACE, the Open reading frame(ORF)of lox3 was 2706 bp in length, encoding 901 amino acids, we named it CsLOX3（GenBank：HM440161）, we calculated the molecular mass and pI were 101.84 kDa and 6.39. the amino acid sequence homology of CsLOX2 and CsLOX3 was 80% by compariso