茶树谷氨酰胺合成酶和茶氨酸合成酶基因原核表达、抗体制备及其表达差异的研究-食品科学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 茶氨酸是茶树体内特有的氨基酸，不仅是茶的主要呈味物质，也是其主要功 能成分，可以改善人体免疫功能，提高抵抗力等。茶氨酸合成酶(TS)和谷氨酰胺 合成酶(GS)是茶氨酸代谢途径中的两个关键酶。谷氨酰胺合成酶广泛存在于原核 与真核生物体内，是参与高等植物体内氨同化过程的关键酶；茶树根部以 GS/GOGAT为主要途径，利用无机氮合成谷氨酸及其酰胺。提高谷氨酰胺合成酶 的活性，有利于茶树体内茶氨酸的合成。茶氨酸合成酶直接参与了茶树体内的茶 氨酸合成，前人虽已从茶鲜叶中分离出茶氨酸合成酶，并进行了初步的酶学特性 研究，由于其极不稳定，难以进一步分离纯化，相关研究一直停滞不前。 本文对茶树的TS和GS基因进行了体外表达，纯化获得目的蛋白后通过免 疫家兔制备获得抗体，利用免疫印迹杂交技术从蛋白水平上检测盐胁迫和遮荫 处理条件下茶苗根和新梢中TS、GS的表达差异；采用HPLC方法检测了样品 中游离氨基酸的含量，探讨NaCl处理和遮荫处理对茶树体内TS、GS的表达 以及对游离氨基酸代谢的影响。论文取得以下主要结果： 1. 茶树TS和GS基因导入表达质粒pEASY-TS、pEASY-GS，并转入大肠杆 菌Reastta Good中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导大量表达，分析诱 导前后SDS胶，发现诱导后包涵体蛋白约在40 kDa处出现目的条带，与预 期结果相符，经Ni-NTA 亲和层析柱纯化获得目的蛋白，免疫家兔获得抗血清， 免疫印迹结果表明重组茶树的TS、GS具有良好的免疫原。 2. 以盐处理及遮荫处理后茶籽苗的茎叶和根部为试验材料制备粗蛋白提取 液，经过SDS后转膜，采用Western blot和ECL显色，检测TS、GS在样品 中的表达情况。结果显示，低浓度NaCl处理和适当的遮荫处理可以提高茶树中 TS、GS的表达量；HPLC检测样品中的游离氨基酸尤其是茶氨酸及谷氨酰胺的含 量，结果表明，遮荫及盐胁迫处理后，茶树体内茶氨酸等游离氨基酸的含量明显 增加。说明遮荫及盐处理有利于茶树体内茶氨酸等游离氨基酸的积累，能提高茶 叶的品质。 关键词：茶树；茶氨酸；茶氨酸合成酶；谷氨酰胺合成酶；蛋白质印迹法；表达 差异 I II Abstract Theanine, the characteristic amino acid in tea leaves, which is not only the main flavor substances, but also the main functional component of tea. Theanine can be served as the potential nutrient to strenthen human immune defense system. γ-Ethylamino-L-glutamic acid (TS) and glutamine synthase (GS) are key enzymes involved in theanine metabolism of tea plant. Glutamine synthase widely exists in prokaryotes and eukaryotes, and also is the key enzyme for the ammonium assimilation in higher plant. GS-GOGAT cycle was the main pathway of ammonium assimilation at tea roots. Increasing the activity of GS is benefit for the theanine synthesis. γ-Ethylamino-L-glutamic acid is the key enzyme in theanine metabolism. Preliminary investigation of theanine synthetase and its enzymatic properties had been performed. While the theanine synthetase is extremely instable and difficult to be further separated and purified, no approaches concerned with theanine synthetase was achieved. In this paper, GS and TS in leaves and roots of tea plant