茶树酯型儿茶素生物合成代谢相关酶检测方法及初步纯化研究-生理学专业论文.docxVIP

摘 要 儿茶素是茶树的重要次生代谢产物，不仅是构成茶叶品质的主要化学成分，也是 茶叶的主要药理功能成分。其中酯型儿茶素的保健功能要高于非酯型儿茶素。茶树中 非酯型儿茶素的生物合成途径业已清晰，但酯型儿茶素的合成代谢途径及分子调控机 理仍是研究难题。 本课题前期工作发现，茶树酯型儿茶素合成途径包含两步反应，即没食子酸(gallic acid, GA) 先 在 UDPG 的 没 食 子 酰 葡 萄 糖 基 转 移 酶 (UDP-glucose:galloyl-1-O-β-D-glucosyltransferase，UGGT)作用下，形成 1-O-没食子酰 -β-D- 葡萄 糖(βG) 。 βG 作为 活化 的没 食 子供体 ， 在表 儿茶 素 没食 子酰 基 转移 酶 (epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose O-galloyltransferase，ECGT)的作用下，将没食子 基团转移到非酯型表儿茶素的 C 环-3-位点上，形成酯型儿茶素。同时酯型儿茶素也 可以被茶树中酯型儿茶素水解酶(galloylated catechins hydrolase, GCH)水解成非酯型 儿茶素和没食子酸。 本文以茶树鲜叶为材料，研究 GCH 、UGGT 和 ECGT 活性检测体系的影响因素 （包括最适反应时间、最适温度、最适 pH、最适底物浓度），建立较为简单的酶活性 检测方法，为进一步分离纯化酶蛋白，打下良好的基础；并利用蛋白质分离纯化技术 对 GCH 进行了初步纯化。旨在为深入探讨茶树儿茶素合成及其代谢的分子机制奠定 基础。 主要研究结果如下： 1.利用高效液相色谱方法，对 GCH、UGGT 及 ECGT 酶的酶促反应产物进行了 定性的检测。 2. 建立了 GCH、UGGT 及 ECGT 三种酶的最适检测体系。分别为： （1）GCH 最适反应体系：2.5 mL 反应体系包括 0.2 mmol/L EGCG(ECG 或 GCG)， 4 mmol/L 抗坏血酸，0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.5)，粗酶提取液若干(含 0.4 mg 蛋白)， 于 30℃下反应 30 min。 （2）UGGT 最适反应体系：1.5 mL 反应体系包括 1.4 mmol/L GA，2.3 mmol/L UDPG，4 mmol/L 抗坏血酸，1.5 mmol/L 水杨酸，0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)，粗 酶提取液若干(含 0.55 mg 蛋白)，于 30℃下反应 90min。 （3）ECGT 最适反应体系：1.5 mL 反应体系包括 0.38 mmol/L EGC 或 EC，0.8 mmol/L 1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（βG），4 mmol/L 抗坏血酸，1.5 mmol/L 水杨酸， 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)， 粗酶提取液若干(含 0.55 mg 蛋白)，于 30℃下反应 60min。 I I II 3. 利用硫酸铵分级沉淀、Q Sepharose FF 离子交换层析和 Superdex 200 凝胶层 析对 GCH 进行了分离纯化，其比活力增加了 1.71 倍, 回收率为 9.9％。用 SDS 检测纯化后酶的纯度，结果显示分离效果有待进一步提高。 关键词：茶树 ；酯型儿茶素合成酶；酯型儿茶素水解酶；检测体系；纯化 PAGE PAGE IV Abstract Catechins, as the main secondary metabolites, are not only the main components of quality of tea, but also the major pharmacological features of tea. The health function of galloylated catechins is superior to that of nongalloylated catechins. Up to now, the biosynthesis of nongalloylated catechins in tea plant has been fully investigated, but the biosynthesis pathways and molecular mechanism of galloylated catechins are still not clear. In our previous work, we found that the biosynthesis way of galloylated catechins contained two-step reactions: