草鱼呼肠孤病毒感染对草鱼细胞RNAi信号通路激活方式的影响-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 II II mRNA 中 egfp mRNA 的表达情况。结果显示，GCRV 感染的 CIK 细胞中共转染 pEGFP-N1 和 EGFP-siRNA 的实验组有很强的荧光信号与只转染 pEGFP-N1 的信号 强度相似，另外 GCRV 感染的 CIK 细胞共转染 pEGFP-N1 和 EGFP-siRNA 的实验 组 egfp mRNA 的表达量也与感染细胞只转染 pEGFP-N1 的对照组相似，它们都高 于未感染细胞共转染 pEGFP-N1 和 EGFP-siRNA 的对照组。说明感染 GCRV 的 CIK 细胞中 siRNA 介导的基因沉默受到了抑制； ③研究了 GCRV 的复制与 Dicer 转录水平的相互关系。提取 GCRV 感染后 0h， 4h，8h，12h，16h，20h，24h 以及 28h 的 CIK 细胞总 RNA，利用 qRT-PCR 测定 每个时间点 Dicer 的表达量以及用 TCID50 测定各时间点的病毒滴度。结果显示， 从第 20h 开始 Dicer mRNA 大量表达(P﹤0.05)，TCID50 结果表明从第 20h 病毒复制 量达到一个很高的水平，对二者进行相关性分析，相关系数 R2 为 0.9572，说明 Dicer mRNA 的表达量与病毒滴度有较高的相关性，GCRV 的复制促进了 Dicer mRNA 的表达。 结论： CIK 细胞中存在 RNAi；GCRV 裸链基因组 dsRNA 对 RNAi 是敏感的， 而 GCRV 的感染能抑制细胞中的 RNAi，而且 Dicer 基因的转录水平与 GCRV 的复 制成正相关性。 关键词：草鱼呼肠孤病毒，RNA 干扰，小干扰 RNA，双链 RNA III III Abstract Grass carp(Ctenopharyngodon idellus), member of cyprinid family is a popular commercial fish species in China, and accounts for about 23% of the annual aqucultural production in China. Grass carp reovirus (GCRV), pathogen of haemorrhagic disease, is prevalent, harmful, and leads to high mortality. It’s the one of the most prominent prob- lems of freshwater aquiculture in China. So far, there have been no effective drugs or measures to control the viral infection. Therefore, characteritation of GCRV has an impo- rtant significance. RNA interference (RNAi) is a small interfering RNA(siRNA)-mediated gene sile- ncing mechanism. It widely exists in many organisms. Because of its highly specificity and efficiency, RNAi might be a new tool for controlling virul replication. The purpose of this study is to effect of Grass carp reovirus infection on triggering the RNAi signal pathway in grass carp cells, the main experiments are as follows: To prove whether RNAi exists in Ctenopharyngodon idellus kidney cells(CIK). Plasmid pEGFP-Nl and in vitro synthesized egfp (fluorescin gene)specific double-stranded RNA (EGFP-dsRNA) were co-transfected into CIK cells. The gene silencing effects were monitored through inverted fluorescent micr