多孔纳米羟基磷灰石壳聚糖支架材料复合成骨细胞的异位成骨实验分析-口腔临床医学专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 - - PAGE 1 - 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 HA hydroxyapatite 羟基磷灰石 nHA nano- hydroxyapatite 纳米羟基磷灰石 CS chitosan 壳聚糖 GS glucosamine 氨基葡萄糖 nHA/CS nano-hydroxyapatite/chitosan 纳米羟基磷灰石/壳聚糖 MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴盐 ALP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 SEM scanning electron microscope 扫描电镜 TEM transmission electron microscope 透射电镜 XRD X-ray diffraction X 线衍射 FTIR Fourier transform infrared spectroscopy 傅立叶变换红外光谱分析 BMSCs bone marrow mesenchymal stem cells 骨髓间充质干细胞 多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架材料复合成骨细 胞的异位成骨实验研究 摘 要 背景：目前，对于牙列缺损的修复分为活动义齿修复、固定义齿修复和种植义齿 修复。由于种植义齿修复时不损伤天然邻牙，具有很好的美学效果，能更好的行 使功能等优点，其越来越受到患者的青睐。然而，在进行种植治疗时常因各种原 因导致的骨量不足而需要进行植骨来满足相应的骨量要求。由于自体骨移植和异 体骨移植均具有各自的缺点，均不可称为理想的骨移植材料。近年来利用骨组织 工程技术来作为骨移植材料成为研究的热点，并为骨缺损的修复带来了希望。由 于自然骨是由磷灰石和高分子胶原纤维构成的无机-有机复合物，因此仿生的复合 支架材料逐渐受到广泛的重视。目前，高分子生物材料与羟基磷灰石(HA)复合来 制备人工骨成为研究的热点。常用的高分子材料为：明胶、壳聚糖(CS)等。 目的：本实验中，我们自主合成了多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖（nHA/CS）支架 材料，并对材料进行表征。选用 SD 大鼠的成骨细胞作为种子细胞，与多孔 nHA/CS 支架材料进行体外复合培养，检测其细胞毒性，并用成骨细胞与多孔 nHA/CS 支 架来构建组织工程骨，将其植入到 SD 大鼠股部肌袋模型内来观察细胞复合物的异 位成骨能力。 方法：(1)采用共沉淀法和粒子沥滤法制备多孔 nHA/CS 支架材料，并对材料行 X 线衍射（XRD）、傅立叶变换红外光谱分析（FTIR）、扫描电镜（SEM）和透射电 镜（TEM）来进行表征。(2)分离培养 SD 大鼠成骨细胞，采用细胞碱性磷酸酶(ALP) 染色来进行鉴定，倒置显微镜下逐日观察细胞的形态和增殖情况。将第 3 代成骨 细胞与多孔 nHA/CS 支架材料体外复合培养,采用 MTT 比色法来检测支架材料对 细胞增殖的影响，评价支架材料的细胞毒性。用 spss13.0 软件包对测定结果进行重 复测量设计的方差分析。(3)建立 SD 大鼠股部肌袋模型，体外构建细胞支架材料 复合物，将其植入右侧肌袋为实验组，单纯的 nHA/CS 支架材料植入左侧肌袋作 为对照。分别在植入 2，4，6，8 周后，将植入的支架材料取出行苏木精-伊红染 色和 Masson 染色观察新骨形成情况，并应用 JEDA-801D 形态学图象分析系统计 算新骨生成率。用 spss13.0 软件包对测定结果进行重复测量设计的方差分析。 结果：（1）复合材料通过 XRD 和 FTIR 检测证实所制备的复合材料中的单一组份 为 HA 和 CS。制备的复合材料经扫描电镜和透射电镜观察,证实合成的复合材料粒 子大小在 40-60nm 之间是纳米级材料，材料表面有着大小不等的宏观空隙，孔壁 上也分布着 200nm 到数纳米不等的微孔，呈三维的网状结构。(2)经原代、传代培 养成骨细胞生长良好，细胞形状不规则，多呈三角形、多角形，有较多突起。ALP 染 色 可 见 成 骨细 胞 的胞 浆 中 有 浅 棕色 至 棕黑 色 色 素 颗 粒 。 成骨 细胞可在多孔 nHA/CS 周围贴壁生长、并且附着和增殖，其生长及功能不受抑制。(3) 在各观察 时间段内成骨细胞复合多孔 nHA/CS 组新骨生成量均多于 nHA/CS 组，在新生的骨 组织中有血管的出现。 结论：（1）多孔nHA/CS无细胞毒性，有利于细胞的黏附和增殖。（2）多孔nHA/CS 复合成骨细胞支架材料具有异位成骨能力，可以用于骨组织工程支架材料。 关键词