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对虾白斑综合征病毒细菌人工染色体基因组的构建分析-食品科学与工程专业论文
上海海洋大学硕士学位论文
上海海洋大学硕士学位论文
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Cloning the genomic DNA of white spot syndrome virus as bacterial artificial chromosome
ABSTRACT
White spot syndrome virus, WSSV, can cause massive death in cultured shrimp in a short time, was the major pathogen of shrimps. Since the first discovery in north of Taiwan in the early 1990s, WSSV has been spread all over the world, leading to a serious economic loss for the shrimp aquaculture.
Because of the lack of susceptible cell lines for WSSV continuous culture and genomic DNA operation system in vitro, the research about WSSV virological character makes Slow Progress. So we attempted to establish the virus genomic DNA operation system by viral bacterial artificial chromosome which could clone and modify the viral genome in vitro, discuss the function of virus gene, find out the key proteins in the oral infection process. The BAC system of WSSV is based on a transposon with the Escherichia coli mini-F factor replicon. The transposon insert to the WSSV genomic DNA by transposition reaction, enable the exogenous DNA could replicate in E. coli as a single copy. After screening the positive colonies by using selective plates for the existence of chloramphenicol marker gene, we screen the positive colonies by using colony PCR and colony in situ hybridization, obtain the colonies with WSSV::BAC in it.
To solve the low rate of successful establishment for the huge size of virus genome, the research applied electroporation with E. coli DH10B as the competent cell for contain exogenous large DNA, rose the mole number of WSSV genomic DNA and transposon in the transposition system, induced the ionic concentration of transformation system, extended the electro shock time constant. The result indicated it can enhance the success rates, and obtained more positive colonies.
The PCR primer pair and ISH probe were specific for WSSV vp26 gene. We used colony PCR and colony in situ hybridization to screen the positive colony. The result reve
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