对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110的表达纯化研究-食品工程专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 韩继刚 中国科学院 教授 主席 陈兰明 上海海洋大学 教授 委员 严继舟 上海海洋大学 教授 委员 吕利群 上海海洋大学 教授 委员 委员 委员 委员 喻勇新 上海海洋大学 助教 秘书 答辩地点 食品学院 A209 答辩日期 2015.6.3 上海海 上海海洋大学硕士学位论文 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白 VP110 的表达纯化研究 摘 要 本文通过对 WSSV 囊膜 VP110 序列进行 blast 和 alignment 分析后发现， vp110 和 pif2 有相似性，而 pif2 是杆状病毒经口侵染因子。进一步序列分析发现， VP110 和 PIF2 均在 N 端有高疏水性区域，且为跨膜区。我们将 WSSV VP110 与 昆虫 DNA 病毒 Baculoviruses、Nudiviruses、Hytrosaviruses 等的 PIF2 蛋白序列 最相似的，不包含疏水性较高的 N 端区域的 150 到 600aa 定义为 sVP110，将其 基因序列克隆到 pET-16b 表达载体上。对表达条件如温度、时间、诱导剂浓度和 诱导时间进行优化，高表达无断裂的融合蛋白 sVP110-His，经 GE 蛋白纯化仪 AKTA Pure 系统纯化后，蛋白纯度达到 80%以上。复性条件经过不断探索、优化 后，选择了最佳复性条件 6 mol/L 的尿素溶液 4℃透析 1 h，接着使用 4 mol/L 尿 素溶液透析 4 h，最后用 2 mol/L 尿素溶液透析 2 h，成功完成透析复性。使用超 滤管超滤浓缩复性成功的蛋白 sVP110-His，得到高浓度、高亲水性的 sVP110-His 蛋白，浓度达到 600.83 mg/mL，总量完全满足制备兔源多克隆抗体的要求（≥3 mg）。将制备成功的融合蛋白 sVP110-His 作为抗原免疫兔子，成功的制备出特 异性高，亲和性好的多克隆抗体，抗体的效价达到 1：23,000。这为进一步验证 WSSV 的经口侵染以及 VP110 与围食膜蛋白的相互作用打下了基础。 我们将 VP110 功能区域(150aa-610aa)构建到载体 pQE80-ZZtev、pET-16b、 pGEX-4T1 和 pET-32a，经过对原核表达的条件的摸索：如改变诱导温度、尝试 低温表达、诱导时间延长及缩短、诱导剂浓度的摸索（1 mmol/L、0.1 mmol/L）； 尝试不同的表达菌株 BL21、Rosetta 和 OrigamiB；最终用 N 端带有提高蛋白可 溶性的硫氧还原蛋白标签和两端均有用于纯化的 his 标签的 pET-32a 载体，成功 的表达出可溶性融合蛋白 sVP110-Trx，并对其进行了纯化优化摸索，得到可溶 性的融合蛋白 sVP110-Trx。 本文在研究过程中，尝试表达 VP110 全长蛋白。选用了不同的表达载体、 不同表达菌株，并对表达条件进行优化。结果表明，VP110 全长以包涵体形式表 达。上清中含量极微或者完全检测不到。三种表达菌株 BL21、Rosetta 和 OrigamiB 中，Rosetta 的表达能力最好，BL21 次之，OrigamiB 最差。三株菌的最适表达条 件均为 1 mmol/L 的 IPTG 和 30℃的诱导温度。三个不同标签的表达载体 pGEX-4T1、pET-16b、pET-32a 中，pET-32a 的融合蛋白 VP110-Trx 的表达量在 I 万方数据 万方数据 同样条件下最高，pET-16b 的融合蛋白 VP110-His 的表达量次之，pGEX-4T1 的 融合蛋白 VP110-GST 表达量最低。尽管优化表达后，VP110 始终以包涵体的形 式表达，然而，我们是首次获得 VP110 全长表达。 关键词：WSSV，VP110，原核表达，纯化，多克隆抗体 II PAGE VI万方数据 PAGE VI 万方数据 Expression and purification of VP110, an envelope protein of WSSV ABSTRACT Based on sequence analysis, we found that WSSV vp110 shared similarity with pif2 that is one of per os infectivity factors of baculoviruses and functions as transporting viruses into host epitheliums, and N terminus of both VP110 and PIF2 is high hydr