对虾白斑综合症病毒LAMP及变性高效液相色谱检测方法的建立与应用渔业专业论文.docxVIP

摘 摘 要 摘 要 据对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的基因保守序 列，利用引物设计软件 Primer Explorer V3，设计了六条引物，建立了一种对虾 白斑综合症病毒的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 检测方法，并对 LAMP 反应时间、温度等反应参数进行了优化。该检测方法特 异性好，与传染性皮下和造血器官坏死病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病 毒、对虾杆状病毒以及对虾基因组 DNA 无交叉反应；检测灵敏度约为 10-4ng/μl， 比常规 PCR 检测方法灵敏度高，与荧光定量 PCR 检测方法灵敏度相当。该检测 方法耗时短，约 1 个小时即可完成检测。用建立的 LAMP 方法对 46 尾对虾样品 进行了临床检测，结果与定量 PCR 方法检测结果一致。WSSV 的环介导等温扩 增检测方法，准确、特异、灵敏、成本低，适用于 WSSV 的早期及现场诊断。 据对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的基因保守序 列，使用 Primer Explorer V3 软件设计了两条引物，利用 PCR 的扩增产物，结合 变 性 高 效 液 相 色 谱 技 术 ( denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)，建立了一种对虾白斑综合症病毒的 DHPLC 快速检测方法。该检测方 法特异性好，与对虾杆状病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、肝胰腺细小病 毒、斑节对虾杆状病毒以及对虾基因组 DNA 无交叉反应；检测灵敏度较高，约 为 10-5ng/μl，高于常规 PCR 及荧光定量 PCR 检测方法的灵敏度。用建立的 DHPLC 方法对 100 尾对虾样品进行了临床检测，结果与荧光定量 PCR 方法检测 结果一致。WSSV 的 DHPLC 检测方法，特异性强、灵敏度高，是对 WSSV 进行 有效检测的一种新方法。 关键字：对虾；白斑综合症病毒；环介导等温扩增；变性高效液相色谱；检测 Abs Abstract Establishment and application of Loop-mediated Isothermal Amplification and Denaturing High-performance Liquid Chromatography for White Spot Syndrome Virus Abstract A set of six specific primers were designed based on conservative gene of white spot syndrome virus (WSSV) using Primer Explorer V3 software. A detection method of WSSV using the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) was established and the parameters such as reaction time and temperature were optimized in this article. The WSSV LAMP assay did not react with infetious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV), monodon baculovirus (MBV), hepatopancreatic parvovirus (HPV), baculovirus penaei (BP) or genome DNA of shrimp, indicating the good specificity. The detection limit of LAMP assay was approximately 10-4ng/μl WSSV DNA, which was comparable to the real-time PCR and higher than that of conventional PCR. Fourty-six clinical shrimp samples were detected with the LAMP method and the results were consistent with the real-time PCR method. The LAMP assay was fast and could be fini