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植物膜蛋白质组学的研究进展 　　摘要：植物膜蛋白质组学的研究是蛋白质组学研究者关注的焦点之一，但由于膜蛋白具有低丰度、疏水性等特点，因此膜蛋白的富集提取、分离鉴定存在很大的难度。从膜蛋白的富集提取、分离鉴定入手，阐述其研究进程，对质膜蛋白、叶绿体膜蛋白、线粒体膜蛋白和液泡膜蛋白等方面的研究进展进行了综述，并对膜蛋白的研究前景进行展望。 　　关键词：植物；膜蛋白；膜蛋白质组学：研究技术 　　中图分类号：Q51　文献标识码：A　文章编号：0439―8114(2009)01―0223―04 　　 　　生物膜具有的主要功能可归纳为：能量转换、物质运送、信息识别与传递等，这些功能在很大程度上决定于膜内所含的蛋白质――膜蛋白。膜蛋白是一类具有独特结构的蛋白质，镶嵌于膜脂的特性使这一类蛋白处于细胞与外界的交界部位，介导细胞与外界之间的信号传导，并执行很多基本的和重要的细胞生物学功能。 　　 　　1 膜蛋白质组学研究技术的发展 　　 　　膜蛋白的研究面临的挑战是膜蛋白(主要是低丰度蛋白、疏水蛋白)的提取鉴定、膜蛋白的定位和功能等方面。现在一些新技术的利用如增溶剂(尿素、硫脲)。新的去垢剂(CHAPS和ASB-14)，以及有机溶剂(CHCl3)等极大地改善了膜蛋白质的溶解性能；同时一些新的双向电泳技术(如：自由流电泳)的利用扩大了膜蛋白的常规分离范围：另外质谱技术的发展使得膜蛋白的鉴定在最近几年取得了较大的发展，这些技术都在一定程度上使膜蛋白具有低丰度、难溶解、等电点时易沉淀、不易酶解等难题得到一定程度的解决。 　　 　　1.1 膜成分的制备纯化 　　获得高度纯化的膜成分是进行膜蛋白研究的基础。制备纯化膜成分的方法很多，在植物材料中以蔗糖密度梯度离心法、两相分配法和自由流电泳(FFE，free flow electrophoresis)等方法为主。 　　有的学者利用亲和两相法提纯了质膜，WGA(麦胚凝集素，wheat-germ agglutinin)能识别质膜表面的糖链，结合糖蛋白质和糖脂，并能与质膜外表面的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖相结合，将WGA共轭结合到葡聚糖上，可将质膜从其他生物膜中纯化出来。生物素-亲和素亲和纯化法可以明显地降低其他细胞器的污染，尤其是线粒体和内质网。经试验，这种方法可将质膜富集400倍并且污染较少，尤其是经高盐(1 mol?L-1KCL)和(0.1 mol?L-1Na2COM3)洗涤后，可以得到很纯的整合质膜片段。 　　 　　1.2　膜蛋白的分离纯化 　　利用蛋白质组学技术比较不同组织器官的膜蛋白组成的差异，分离膜蛋白的技术体系日趋成熟，优化裂解液的成分、优化双向电泳的某些条件都使膜蛋白的分离纯化得到很好的效果。 　　1.2.1 裂解液的改　进单独使用某一种去垢剂都不会最有效地分离膜蛋白，将两性离子去垢剂与非离子型去垢剂结合使用能较好地溶解各种膜蛋白。传统上使用的阴离子去污剂有SDS(十二烷基硫酸钠)、Triton X-100和NP-40。有学者发现用低浓度1％(m/V)SB3-10和1％(m/V)ASB-14与5 mol?L-1尿素、2 mol?L-1硫脲、2 mmol-L-1 TBP、0.2％两性电解质共用时可以有效的提高膜蛋白的溶解性。新型的兼性离子去污剂ASB-14对膜蛋白的溶解效果较好。在通过使用0.1 mol?L-1Na2CO3、Triton X-114等处理质膜后，使用含有ASB-14的裂解液去裂解细胞质膜，经2-DE分离，MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)鉴定了其中的61个点，发现很多疏水性膜蛋白能够在2-DE胶上较清晰地显示出来，其中包含有水通道蛋白和ATPase等内在膜蛋白。 　　1.2.2　双向电泳(2-DE)的改进双向电泳技术一直是蛋白质组鉴定的核心技术，它的发展可以从一定程度上决定蛋白质组的发展程度，因此近年来这一技术的改进也越来越被大家所重视。1996年欧洲的一些科学家利用双向凝胶电泳获得可重复的膜蛋白完全图谱，鉴定了一些质膜特异性蛋白，为238种蛋白的一部分找到了对应的功能，为膜蛋白研究方法的改善提供一个很好的开端。 　　为了更好地分离质膜中的疏水性蛋白，研究出了一套新的双向电泳体系：在第一向等电聚焦中使用琼脂糖作为基质。用4.4-二氨基二苯甲烷(DDM)作为表面活性剂，第二向使用18％-24％的梯度丙烯酞胺、6 mol?L-1的尿素和Tris-MES作为上样缓冲液，成功地分离了集胞藻质膜中的主要平均亲水值大于0.3的疏水性蛋白，并分离鉴定了细胞色素C和亚铁血红素。 　　1.2.3　其他分离技术的改进　用器官组织萃取剂进行单向电泳，是目前用以鉴定几种叶绿体疏水膜蛋白的研究方法之一。这种方法可以富集大多数叶绿体膜疏水蛋白