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植酸酶phy A基因克隆表达的研究 　　摘要 通过PCR从黑曲霉（Aspergillus niger）WY49基因组中扩增出植酸酶phy A基因，将其转入毕赤酵母GS-115中，整合到酵母染色体上进行诱导表达，并对表达条件进行了优化。利用蛋白质分离纯化技术纯化重组酶并进行SDS，结果表明，蛋白质分子量约为61kDa。植酸酶基因表达产物的理论值为50kDa，说明该植酸酶在酵母中有一定程度的糖基化。最后测定了表达产物的酶学性质，结果表明，表达产物的最适pH值为5.5，最适温度为55℃，且具有良好的pH值稳定性和热稳定性。 　　关键词 黑曲霉；植酸酶；毕赤酵母GS-115 　　中图分类号 Q785文献标识码A文章编号1007-5739（2008）13-0255-03 　　 　　植酸（Phytic Acid or Inositol Hexakis-phosphate）是维生素B族的一种肌醇六磷酸，植酸及其盐类广泛存在于植物组织和粮食产品中，占其总量的3％左右，其中磷含量占植物总磷的70％～90％。但是植酸形式的磷不能被单胃动物所消化利用，而且抑制多种营养成分的吸收和利用。 　　植酸酶可以分解植酸，变为可以吸收利用的磷元素。但由于天然植酸酶菌株产酶水平较低，不能满足商业化需求，一般是用天然菌株采用基因工程技术手段进行改造获得基因工程菌，提高酶产量。王红宁[1]等提取出了黑曲霉N25的基因组DNA，采用聚合酶Advangage?蛳HF扩增到去除信号肽的内含子后约1.4kb片段，构建pPIC9k?蛳phyA载体，经G418抗性筛选获得了高效表达的转化子并具有良好的遗传性。贝锦龙等[2]将人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶酶基因导入毕赤酵母表达系统，成功表达了植酸酶。2003年，熊爱生等[3]将化学合成的植酸酶基因连接在含有不同分泌信号序列表达载体上，导入Pichia pastoris中，研究了不同的信号序列对Pichia pastoris表达外源植酸酶的影响。 　　本试验克隆了黑曲霉WY49的植酸酶基因，并研究其在毕赤酵母GS?蛳115中的表达，纯化重组酶并研究其性质，以期获得有商业生产能力的基因工程植酸酶。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1试验材料 　　黑曲霉WY49和大肠杆菌JM109为实验室保存。毕赤酵母（Pichia pastoris）GS?蛳115以及穿梭载体pPIC9K为Invitrogen公司产品。限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaKaRa TaqTM聚合酶和DNA分子量标准DL2000、DL15000均购自大连宝生物工程有限公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1黑曲霉细胞总DNA的提取。利用氯化苄法提取基因组DNA，结合酚/氧仿抽提去除蛋白质等杂质[4]。 　　1.2.2黑曲霉植酸酶phy A的PCR扩增。从GenBank中下载黑曲霉植酸酶phy A基因序列设计PCR引物[5]，在上下游引物中分别引人EcoR I和Not l酶切位点。设计的引物由华大基因公司合成，上游引物为：5′?蛳GCGAATTCCTGGGA GTCTCCGCTTC?蛳3′，下游引物为：5′?蛳GGGCGGCCGCCTA AGCAGAACACTCC?蛳3′。采用常规方法进行克隆。 　　1.2.3酵母转化。将携带黑曲霉WY49植酸酶A基因的重组载体pPIC9K?蛳phyA用SacⅠ酶切后得到携带phy A的线性表达载体，准备电击转化，转化方法见参考文献[6]中酵母的转化。电击完毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的EP管中；将菌体悬液涂布于MD平板上，每200～600μL涂布1块平板；将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。 　　1.2.4重组酵母的诱导和表达。重组酵母接入250mL BMGY培养基中，30℃摇床培养36h，离心收集菌体然后用无菌水洗涤；在转移入100mL的BMGY培养基中，30℃继续培养60h。每隔24h添加大约10g/L的甲醇1mL，以促使其诱导表达。 　　1.2.5重组植酸酶的纯化和SDS?蛳PAGE的鉴定。植酸酶的活性测定方法参照文献进行[7]，酶的活性单位定义为：在37℃，pH值为5.5条件下每分钟水解植酸释放1μmoL的无机磷所需要的酶量为1个酶活力单位。将纯化后的植酸酶用10% SDS?蛳PAGE进行分析。 　　1.2.6重组植酸酶酶学性质的测定。分别在不同pH值与温度条件下，测定纯化后的植酸酶活性，绘制植酸酶活性的pH值曲线与温度曲线。 　　 　　2结果与分析 　　 　　2.1phy A基因PCR扩增结果 　　从图1可以看出，在此PCR反应条件下，获得了1条长约1.6 kb的特异性PCR扩增条带，与phy A基因预期长度一致（如图1