发育期惊厥性脑损伤病理机制及相关因素研究-儿科学专业论文.docxVIP

发育期惊厥性脑损伤病理机制及相关因素研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科 研究生 鲁 娜 导 师 黄亚玲 刘亚黎 教授 中文摘要 第一部分 发育鼠惊厥性脑损伤后神经元凋亡现象观察 目的：凋亡（Apoptosis），又称Ⅰ型程序性细胞死亡，是细胞的一种基本生物学 现象，凋亡在生物体进化、发育及内环境稳定中发挥重要作用。本研究旨在观察 戊四氮诱导惊厥发作后发育鼠大脑皮质和海马神经元凋亡现象。 方法：生后 10 d（P10）Wistar 大鼠随机分为实验组与对照组，实验组动物注射 戊四氮（Pentylenetetrazol，PTZ）诱导惊厥发作，对照组仅注射生理盐水，与实验组 组同期进行。惊厥发作后 24 h，硫堇染色观察海马和大脑皮质神经元形态；TUNEL 染色观察上述部位神经元凋亡情况。 结果：P10 大鼠戊四氮诱导惊厥发作后 24 h，海马、大脑皮质可见单个、散在的 变性、死亡细胞；TUNEL 染色示实验组海马与皮质均可见细胞凋亡。实验组与对照 组海马凋亡指数分别为（5.24±0.76）%与（1.23±0.31）%，大脑皮质分别为（4.93± 0.52）%与（1.16±0.27）%，两部位实验组凋亡指数均高于对照组（P0.05），海马与 皮质两部位比较无明显差异。 结论：发育鼠 PTZ 诱导惊厥发作后，海马及大脑皮质神经元凋亡现象增加，海马 与大脑皮质神经元凋亡程度无明显差异。 关键词：发育鼠；惊厥发作；海马；大脑皮质；凋亡 第二部分 发育鼠惊厥性脑损伤后神经元 aut ophagy 现象观察 目的：自噬（Autophagy）性细胞死亡，又称Ⅱ型程序性细胞死亡。Autophagy 在 细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。本研究旨在观察发育鼠戊四氮诱导 惊厥发作后大脑皮质和海马神经元 autophagy 现象。 方法：生后 10 d（P10）Wistar 大鼠随机分为实验组与对照组，实验组动物注射 PTZ 诱导癫癎发作，发作后实验组动物随机分成 7 组，分别于 2 h、4 h、8 h、16 h、 24 h、36 h、48 h 时间点处死取脑标本。采用 Western blot 方法检测不同时间点 autophagy 效应特异性标记物 LC3-II / LC3-I 在海马与大脑皮质的表达；比较海马与大脑皮质 LC3-II / LC3-I 水平；癫癎发作后 24 h，取脑组织制备冰冻切片，用免疫组化荧光染色 的方法观察 LC3 在海马神经元中的表达；对照组注射生理盐水，与实验组组同期进行。 结果：戊四氮诱导惊厥发作后，海马 LC3-II / LC3-I 水平于惊厥发作后 4 h 开始出 现明显升高，大脑皮质于 8 h 开始出现明显升高，与对照组相比有统计学意义 （P0.05）；二部位在 24 h 均达峰值；海马内 LC3-II / LC3-I 在 4 h 以后各时间点均明 显高于皮质，统计学有显著差异（P0.05）。惊厥发作后 24 h，免疫组化荧光染色示 海马各区 LC3 表达明显高于对照组。 结论：在 PTZ 诱导惊厥发作后，发育鼠海马及皮质神经元内 autophagy 迅速活化， 于 24 h 达峰值；海马内 autophagy 效应出现较皮质早，且程度更高。 关键词：发育鼠；惊厥发作；海马；大脑皮质；Autophagy 第三部分 Aut ophagy 在发育鼠惊厥性脑损伤中的作用研究 目的：自噬（Autophagy）广泛存在于真核细胞，参与正常细胞生长发育和生理 病理过程。自噬过程受一系列复杂的信号分子调控，可在不同疾病或疾病进展的不同 阶段发挥不同的作用。本课题旨在研究发育鼠戊四氮惊厥性脑损伤早期 autophagy 活 化对海马神经元的作用。 方法：生后 10 d（P10）Wistar 大鼠随机分为 PTZ 组、3-MA＋PTZ 组、3-MA 组 及对照组。3-MA＋PTZ 组用 PTZ 诱导前 30 分钟注射 autophagy 抑制剂 3-甲基腺嘌呤 （3-Methyladenine，3-MA），之后 PTZ 组与 3-MA+PTZ 组腹腔注射 PTZ 诱导惊厥发 作。记录大鼠癫癎发作行为学指标，包括潜伏期、惊厥持续时间和 PTZ 注射剂量。惊 厥发作后 24 h 取大鼠海马组织，采用 Western blot 的方法检测 autophagy 特异性标记 物 LC3-Ⅱ的水平；用免疫组化荧光染色的方法观察 LC3 蛋白在海马神经元中的表达； 采用硫堇染色观察海马神经元形态，并进行海马各区神经元计数；TUNEL 染色观察 每组海马神经元凋亡情况。 结果：① PTZ 诱导惊厥发作后，3-MA+PTZ 组大鼠惊厥潜伏期较 PTZ 组缩短， PTZ 注射总剂量减少，而惊厥持续时间增加，死亡