金耳胞外多糖体外抗氧化的作用的研究.docVIP

金耳胞外多糖体外抗氧化的作用的研究 　　对金耳(Tremella aurantialba)胞外多糖抗氧化作用进行研究，结果发现金耳胞外多糖能显著地抑制H??2O??2诱导的红细胞溶血，降低肝细胞的自氧化与诱导氧化产生的丙二醛（MDA），并能抑制氧化引起的肝线粒体肿胀度。 　　金耳； 胞外多糖； 抗氧化?? 　　S567.34??A 　　 　　金耳 (Tremella aurantialba) 为银耳目、银耳科、银耳属的一种名贵珍稀的食药用菌。多糖作为药物的研究始于20世纪40年代。50年代末，由于发现了真菌多糖的抗癌作用，促使人们更加系统深入地开展多糖研究。瞿伟菁等报道了金耳胞内多糖具有降血糖活性［1-3］，而胞外多糖的生理活性却未见报道。本实验研究了金耳胞外多糖（Extracellular polysaccharide of Tremella aurantialba,TEP）的体外抗氧化作用，为进一步开发利用金耳的胞外多糖提供科学依据。?? 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1?Σ牧? 　　1.1.1??菌株 　　金耳(Tremella aurantialba)菌株由中华全国供销总社昆明食用菌研究所刘正南实验室提供。?? 　　1.1.2?κ约? 　　三氯乙酸、硫代巴比妥酸、过氧化氢、抗坏血酸和硫酸亚铁等均为国产分析纯试剂。?? 　　1.1.3?κ笛槎?物 　　雄性SD大鼠购于上海西普尔－必凯公司（许可证号：沪动合证字152号)。?? 　　1.2?Ψ椒? 　　1.2.1??金耳胞外多糖制备 　　50 L通气搅拌反应器发酵培养的金耳发酵液经过滤、离心除去菌丝体后，滤液中加3%NaOH 40 ℃水解4 h，用2 M H??2SO??4调节 pH至10～11过夜。取水解液，用0.1μm膜微滤，滤液用MW5000膜截留，截留液用蒸馏水洗数次至pH中性。浓缩后加入4倍酒精沉淀，并用无水乙醇、乙醚洗涤数次，真空干燥得褐色粉末状金耳胞外多糖粗品。?? 　　1.2.2??金耳胞外多糖对H??2O??2诱导红细胞氧化溶血的测定［5］ 　　2只大鼠尾静脉采血，加入抗凝剂，3000×g离心5 min得红细胞，冷生理盐水洗3次，制成0.5%红细胞悬浮液。各组均取红细胞悬浮液0.5 mL，每组5个平行，加不同浓度（0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的金耳胞外多糖 0.1 mL，最后加入300 mmol/L H??2O??20.1 mL启动反应，37 ℃作用1 h，3000×g离心5 min，生理盐水稀释6倍，取上清液于415 nm处测定吸光度(OD)。?? 　　1.2.3??抗脂质过氧化的测定［6］ 　　迅速取上述1.2.2.1取血后大鼠的肝，用冷生理盐水洗净，冰浴下匀浆，制成10%的肝细胞悬浮液，100×g离心10 min，去除离心后的沉淀得匀浆液。各组取肝匀浆液1 mL, 每组4个平行, 加不同浓度的（0.03、0.3、0.5、0.7 mg/mL）金耳胞外多糖0.1 mL，37 ℃作用1 h, 间或摇晃。加入1 mL 20%三氯乙酸 (TCA)结束反应，再加入1 mL 0.8%硫代巴比妥酸 (TBA),于沸水浴中显色15 min，冷却后3000×g离心10 min，取上清液于532 nm处比色。?? 　　 　　抑制率（%）=（MDAc??MDAs）/ MDAc×100%?? 　　MDAc和MDAs分别为对照处理和样品?? 　　(TEP)处理的OD值。?? 　　1.2.3??3对Fe2+??VitC诱导大鼠肝脂质过氧化的测定 　　各组取肝匀浆液1 mL, 每组4个平行, 加不同浓度的（0.03、0.3、0.5、0.7 mg/mL）金耳胞外多糖0.1 mL，再分别加入抗坏血酸和FeSO??4 (终浓度分别为1 mmol/L和0.1 mmol/L)。37 ℃作用1 h, 间或摇晃。加入1 mL 20%TCA结束反应，再加入1 mL 0.8%TBA,于沸水浴中显色15 min，冷却后3000×g离心10 min，取上清液于532 nm处比色，抑制率计算同上。?? 　　1.2.4?Ω蜗吡Ｌ逯渍投鹊牟舛ǎ?7］ 　　取10%的肝组织匀浆液10 mL，4 ℃ 3000×g离心10 min，弃沉淀，取上清液10000×g离心15 min，沉淀物为线粒体。用生理盐水配制成吸光值为0.5~0.6的肝线粒体悬浮液备用，由FeSO4 VitC产生OH，1.0 mL悬浮液各加入不同浓度（0.4、0.8、1.0 mg/mL）金耳胞外多糖100μL，1 mmol/L FeSO4 50 μL和1 mmol/LVitC 50 μL，在520 nm处测定不同反应时间（5 min、10 min、15 min、