重组人血管内皮抑制素抗小鼠肝癌H22的作用机制的探讨.docVIP

重组人血管内皮抑制素抗小鼠肝癌H22的作用机制的探讨 　　【摘要】 目的：观察重组人血管内皮抑制素（Endostar，恩度）对小鼠肝癌H22的抗血管生成作用，并对其机制进行初步探讨。方法：建立肝癌H22小鼠模型，共32只小鼠，随机分为A、B、C、D组，每组8只。在不同时间分别对各组给药。观察实验第18天小鼠肿瘤体积和微血管密度的情况。结果：实验第18天，接种肿瘤当天开始腹腔给药组（B组）与对照组（D组）肿瘤体积和微血管密度比较差异有统计学意义（P0.05）。接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）与对照组（D组）肿瘤体积和微血管密度比较差异无统计学意义。结论：单独应用恩度（重组人血管内皮抑制素）有抗肿瘤作用，接种肿瘤时用药为最佳给药时机。 　　【关键词】 肝癌； 治疗； 恩度； 重组人血管内皮抑制素； 小鼠； H22肝癌细胞株 　　近代的理论研究发现肿瘤新生血管是肿瘤生长所必需的，实体肿瘤的生长和转移与血管生成密切相关，肿瘤有两种血管：即固有血管和因肿瘤细胞释放VEGF（血管内皮生长因子）生成的新生血管，后者是肿瘤生长的决定条件。重组人血管内皮抑制素注射液（Endostar，YH-16恩度）是我国学者自主创新研发的新型人血管内皮抑素，其联合化疗治疗NSCLC（非小细胞肺癌）有确切疗效，但对其他恶性肿瘤治疗的效果鲜有报道，从基础研究资料看恩度的作用都指向抗血管生成，所以借助于鼠模型观察恩度应用后肿瘤组织的生长情况，则能为下一步确定恩度的作用机制建立研究平台。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 肝癌H22瘤株，由中国药品制品鉴定所引进。4～5周龄昆明小鼠，雄性32只，平均体重19～22 g/只，由山西中医院研究所动物室提供。 　　动物室室温22～24 ℃，相对湿度40%～45%，日光灯12 h人工照明，专用鼠粮自由进食，洁净水自由饮用，动物实验室为清洁级。 　　1.2 方法 将冷冻保存在-80 ℃冰箱中的H22肝癌细胞复苏后，注射入昆明小鼠左腋下，7 d后，肿瘤生成明显。在无菌条件下取肿瘤，以培养液调整其中瘤细胞密度至1×107个细胞/ml，用注射器吸取肿瘤悬液0.2 ml注入32只4～5周龄的雄性昆明小鼠右腋下的皮下进行接种，建立动物模型。将32只小鼠按随机分组方法，分成A、B、C、D组，每组8只。A组开始给药时间为实验第1天。实验第5天所有小鼠接种肿瘤。恩度3 mg/kg注入腹腔，1次/d，直至小鼠被处死或小鼠死亡。实验第18天处死小鼠，留取肿瘤组织。A组于实验第1天（接种肿瘤前）开始给药。B组于实验第5天（接种肿瘤日）开始给药。C组于实验第9天（接种肿瘤日后第4 d）开始给药。D组对照组，只造模不给药。眼眶取血后处死小鼠，解剖出肿瘤称重。将全部标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片。免疫组化染色，抗CD34单克隆抗体标本。实验药物：恩度注射液（重组人内皮抑制素注射液）由山东先声麦得津生物制药有限公司生产，批实验试剂：抗CD34单克隆抗体。 　　1.3 实验数据收集 小鼠肿瘤指标测定：将接种后的昆明小鼠喂养在清洁级动物室内，每日使用电子天平测量各小鼠体重。从实验第9天开始每日使用游标卡尺测量各小鼠右腋下肿瘤大小（单位为mm），计算肿瘤体积。肿瘤体积=长径×横径2/2。 　　1.4 染色结果判定及微血管密度的测定 CD34在光镜下将血管内皮细胞标染为棕黄色。采用Weidner等提出的方法对研究结果进行MVD量化分析。首先在40倍光镜视野下扫视整个切片寻找血管高密度集中的区域作为“热点”，这些区域通常位于肿瘤边缘区域的纤维组织中。然后在100倍光镜视野下计数微血管数目，各计数5个高倍视野，取其平均值作为该标本的微血管数。凡单个孤立的或多个紧密排列的内皮细胞团，只要与邻近肿瘤细胞及周围结缔组织成分分界清楚，不论有无血管腔，即可计数为1个微血管数。 　　1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0专用统计软件进行数据统计分析。计量资料以（x±s）表示，用单因素方差分析对实验数据结果进行方差齐性检验和统计分析，进一步采用LSD-t检验对数据进行多组间的两两比较分析与推断。P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　实验第18天，接种肿瘤当天开始给药组（B组）与对照组（D组）肿瘤体积及微血管密度比较差异有统计学意义（P0.05），接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）与对照组（D组）肿瘤体积及微血管密度比较差异无统计学意义。见表1。 　　3 讨论 　　恩度（重组人血管内皮抑制）是我国第1个上市的血管生成抑制剂类抗肿瘤药物（恩度），在针对非小细胞肺癌（NSCLC）联合化疗的临床试验中显示出良好的疗效[1]。也有文献报道，单独用恩度治疗仅3%