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重组人生长激素稳定性的研究进展 　　中图分类号：R944.9　文献标识码：A　文章编号：1006-1533-(2010)09-0414-03 　　 　　随着生物技术的发展，多肽类药物在临床上的应用越来越广泛，相应的制剂学研究也日益受到重视。与传统小分子有机药物相比，多肽具有稳定性差、体内半衰期短和生物膜透过性差等特点。在我国，重组人生长激素主要用于儿童内源性生长激素缺乏引起的矮小症、Turner综合症、成人GHD、烧伤及创伤的修复等治疗。随着临床研究的深入，其在抗衰老、骨质疏松和心血管疾病的治疗方面亦显示有很好的疗效。近年来，重组人生长激素相关研究已成为国内外学者研究的热点之一，研究范围从工程菌培养、生产、发酵、纯化、冻干，一直延伸到制剂的改良和稳定性提高等。本文就重组人生长激素的稳定性研究进展作一综述。 　　 　　1 人生长激素的结构特性和生理作用 　　 　　人生长激素(hGH)是由脑垂体前叶分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，含191个氨基酸残基，分子量为22 KDa，有两个二硫键，无糖基化，是人出生后促生长的最重要激素，有很强的种属特异性。hGH是一种具有广泛生理功能的生长调节剂，能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖及脂肪的代谢。hGH发挥功能作用主要经由两个途径：一是诱导肝细胞、肌细胞产生生长激素介质(somatomedin，SM)，再经由SM间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。无论何种途径，hGH都需要首先同细胞表面特异性受体结合，再由受体介导，激发一系列生化反应并最终产生生物效应。hGH的基本功能是刺激所有机体组织的发育，增加体细胞的大小与数量，hGH的这种促进细胞增殖作用的基础是促进合成代谢。 　　 　　2 引起重组人生长激素不稳定的因素及其物理、化学不稳定性 　　 　　重组人生长激素(rhGH)是一种不稳定的蛋白药物，暴露在生理环境中或与有机溶剂接触易发生聚集，形成可溶性和不溶性的蛋白聚集体。一些物理因素如剧烈搅拌、冷冻干燥和射线辐照等也都会加速rhGH聚集。温度和pH值是影响rhGH稳定性的最重要的因素。由于其结构的复杂性，很难总结出温度对蛋白质结构和功能影响的普遍机理。一般来说，温度越高，稳定性越差。蛋白质和多肽都是两性电解质，当蛋白质处于极端pH值时，分子间静电排斥增加，引起蛋白质折叠，这一过程会导致电荷密度降低，即降低静电自由能。极端的pH值会降低盐桥(salt bridge)的形成能力，这也会导致蛋白质稳定性降低。此外，天然结构与去折叠状态内带电基团的pKa值不同，pH值的改变会影响带电基团的性质，导致结构改变。 　　多肽和蛋白质的不稳定性可以分为两种情况，即物理不稳定性和化学不稳定性。最常见的物理不稳定性是聚合。最常见的化学反应包括以下几种：1)脱酰胺反应。在脱酰胺反应中，Asn／Gin残基水解形成Asp／Glu。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关，提高pH值、升高温度都将有利于脱酰胺反应的进行。2)氧化。多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp和Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。3)水解。多肽中的肽键易水解断裂，由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂。4)形成错误的二硫键。二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。5)消旋。除Gly外，所有氨基酸残基的(3C碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。6)β消除。β消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Set、Thr、Phe和TYr等残基都可通过消除降解。在碱性pH下易发生B消除，温度和金属离子对其也有影响。 　　 　　3 提高重组人生长激素稳定性的途径 　　 　　3.1 化学修饰 　　目前研究最多的是聚乙二醇(PEG)修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可保持或提高原生物活性。通过高效液相色谱法(HPLC)可对修饰结果进行评价。 　　 　　3.2 使用添加剂 　　稳定蛋白质类药物常加入的辅料有糖类、多元醇、表面活性剂、盐、氨基酸和大分子化合物等。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，从而提高多肽的稳定性；表面活性剂可降低蛋白质溶液的表面张力，抑制蛋白质在疏水性表面的聚集、沉淀和吸附或阻止蛋白质的化学降解；盐类可以起到稳定蛋白质的作用，也可以破坏蛋白质的稳定性，这主要取决于盐的种类、浓度