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加工番茄无离层突变及离区JOINTLESS基因序列剖析 　　摘要：以加工番茄有离层品种09872和无离层品种08003为试验材料，分别提取基因组DNA及有离层品种09872的花梗离区总RNA，设计引物扩增并测序，得到JOINTLESS基因序列（1286bp）、jointless（j）突变序列（347bp）及JOINTLESS基因表达序列（797bp）。采用生物学软件对序列进行生物信息学分析，结果表明，加工番茄的JOINTLESS基因编码序列与普通栽培番茄品种相比，有2个碱基发生突变；jointless（j）突变是由JOINTLESS基因第1个外显子的部分序列连同起始密码子上游共939bp的碱基缺失所引起；JOINTLESS基因共编码265个氨基酸，预测所得的蛋白质整体表现为亲水性。经系统发育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列与矮牵牛中该基因序列相似性最高，与葡萄物种的相似性最低。 　　关键词：加工番茄；离区；JOINTLESS基因；突变；序列分析 　　中图分类号：S641.203文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0030-04 　　加工番茄是普通番茄的一个栽培种[1]。随着番茄加工产业的兴起和快速发展，作为专门用于加工的番茄品种，以其果皮厚、耐储运、番茄红素含量高以及矮化自封顶、免去整枝搭架的麻烦等特点而越来越受到人们的重视。番茄的落花落果特性严重影响番茄的产量。研究发现，无离层番茄品种不仅可以改善番茄生长过程中外界环境引起的落花落果情况，保证番茄产量；而且可以提高机械收获和后续加工效率，同时，可以减少运输过程中果柄对果实造成的机械损伤，对提高果实品质也具有一定的意义。 　　目前，对番茄花梗离区的研究已成为热点，并取得重要突破。番茄离区发育控制基因J（JOINTLESS）是MADS-box基因家族的一员，它的突变会引起番茄果柄或花柄离区的消失。1994年Wing等报道，通过构建遗传和物理图谱，以TG523作探针，用Southen杂交，将J定位在番茄细菌人工染色体TY142不足50kb的片段内[2]，并报道首次分离了与离区发育直接相关的基因J[3]。通过重组与反义抑制试验，肯定J是一个新的LeMADs-box基因，转录物表达的时空模式显示，J在花柄离区发育中的特异性是转录后水平上调节的，转基因互补试验证实番茄果实离区正是由这个基因控制的[4]。本试验通过对加工番茄无离层突变的原因及加工番茄中JOINTLESS基因序列进行分析，从分子水平阐述无离层突变发生的原因，以期为无离层加工番茄品种的选育及应用奠定理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1植物材料试验于2012年秋季在东北农业大学园艺站进行，有离层加工番茄品种09872和无离层加工番茄品种08003均由东北农业大学番茄课题组提供，并于日光温室内进行正常栽培管理。选取番茄植株幼嫩叶片，装入1.5mL离心管内，投入液氮中冷冻5min，于-80℃超低温冰箱中保存备用。 　　1.1.2载体与菌株pMD18-T购于宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；大肠杆菌（Escherichiacoli）感受态DH5α购于北京全式金生物技术有限公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1JOINTLESS基因片段的克隆采用CTAB法分别提取有离层品种09872（J）和无离层品种08003（j）的基因组DNA。根据NCBI基因序列AF275345，用Primer5.0软件设计引物F：5′-ATAGGGTAGAGAGGTTTTTTCC-3′，R：5′-CGTAGGCTAAAAGGCGTAG-3′。PCR反应体系为buffer（Mg2+）5μL、2.5mmol/LdNTP4μL、引物R2μL、引物F2μL、模板DNA1μL、5U/μLTaq1μL、ddH2O35μL。反应条件为：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃5min，40个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，经生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速纯化/回收试剂盒回收纯化目的片段，并按原体系进行二次扩增；将二次扩增的产物与pMD18-TVector载体重组连接，转化大肠杆菌感受态细胞，并选择阳性克隆送生物工程（上海）股份有限公司测序。 　　1.2.2花梗部JOINTLESS基因cDNA克隆取有离层品种09872（J）植株幼嫩的花梗区，采用Trizol法（北京康为世纪生物科技有限公司）提取总RNA，逆转录合成cDNA（Promega公司的M-MLV），根据NCBI基因序列AF275345，用Primer5.0软件设计引物F：5′-TCCCTCTTTCTTCAACTCTC-3′，R：5′-ATCTCATGTATTCGTC