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昆虫分子生物学课程论文 学院: 课程: 学号: 姓名: 任课教师: 成 绩: 植物保护学院 昆虫分子生物学 职称：教授 2015年8月29日 PCR技术在微生物鉴定中的应用 随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测屮 的应用。细菌16SrDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表 型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸罝疑。同时，随着微生物检测技术的不断发 展，BOX-PCR技术在微生物的多样性研宄屮也已得到应用。使用真菌HS区域序列通用引物PCR扩增 和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见 的和疑难真菌菌种快速鉴定。 关键词 PCR； 16S rDNA； BOX-PCR； ITS；细菌;真菌 PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶镀式反应，它是一种体外酶促合成扩增特 定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了 PCR技术并由美国Cetus公司开发 研制11］。随着科学技术的发展和突破，PCR技术己在多个领域得到广泛地应用，如微生物 检测、兽医学、水产养殖、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、 构建cDNA文库、遗传病传染病的诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病 学调查等。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其 应用领域也在不断延伸［2＜。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生 出了许多技术，如多重PCRCmutiplex, PCR)技术14］、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)技术［5］、单分子 PCR 技术［6］等。 PCR技术原理 PCR技术是根据待扩增的己知DNA片段序列，人工合成与该DNA2条链末端互补的 2段寡核苷酸，引物在体外将待检DNA序列模板在酶促作用不进行扩增。PCR的整个技 术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA 模板变性，即模板DNA在93?94°C的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2 个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55°C退火；第3步是延伸，即在4种dNTP 底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’?3’方向延伸与模 板互补的新链P1。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进 行。循环进程屮扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25?30次, DNA可扩增100万?200万倍［1］。 PCR技术在细菌鉴定中的应用 细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中 细菌的分离培养最为关键，但对苛养菌及生长缓慢的细菌分离培养很棘手。近年来各种基 因诊断技术在细菌检测中不断开发利用，尤其是基于聚合酶链反应(PCR)的基因诊断技 术发挥着越来越重要的作用。 2. 1 16S rDNA在细菌鉴定中的应用 16S rDNA是编码原核生物16S rRNA的基因，长度约1500bp,存在于所有细菌、衣原 体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，由多个保守区(conserved region)和与之相间的多个可变区(variable region)组成保守区，为所有细菌共有，细菌之 间无显著差异可变区在不同细菌之间存在一定的差异，具冇细菌属或种特异性。PCR 扩增16S rDNA包含两层含义:在保守区设计PCR通用引物，理论上可将存在于待测标本 中的各种细菌都扩增出来；若选择可变区设计PCR特异性引物，则可将标本中的细菌鉴定 到属种乃至菌株水平，因此16S rDNA已成为细菌鉴别与分类研究中较理想的靶序列19］。 细菌16S rDNA中含有9个可变区，命名为V1-V9区，确定某个可变区内具有细菌种 特异性的序列就可能获得细菌实验室诊断的有用靶点，除V2、V3、V4区稍长外，其他各 高变区序列都很短，没有哪个高变区能区分所有细菌0前，己有很多基于16S rDNA 全长或部分序列的应用研宄：王永智等在对20余种致病菌进行16S rDNA多序列比对的基 础上，设计扩增细菌16S rDNA的荧光定量PCR通用引物，检测血液细菌污染模拟标本［11］; 应燕玲等通过13种标准菌株建立丫一种棊于16S rDNA全长特异性扩增和测序的方法，利 用与Gene Bank数据库比对，成功鉴定出血制品污染的11种未知细菌［12:;美国Maastricht 大学眹学中心研宄的实时定量16SrDNAPCR扩增系统，利用通用探