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甘肃省苹果炭疽病病原鉴定及ITS序列剖析 　　摘要：果实炭疽病是苹果生产中常见的重要病害之一。通过形态特征结合病原菌的内部转录间隔区（internal transcribed spacer sequence，简称ITS）区域比对分析，确定引起甘肃苹果果实炭疽病的病原为胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）。 　　关键词：甘肃省；苹果炭疽病；胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）；ITS序列分析 　　中图分类号： S436.611.1+2文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）10-0089-02 　　果实炭疽病是苹果生产中普遍发生的重要病害，包括果实上的苦腐病（bitter rot of apple）和叶片上的叶枯病（glomerella leaf spot）[1]。典型的苹果炭疽病病菌通常仅危害果实，引起果实表面形成圆形病斑，后期产生呈同心轮纹状排列的小粒点，病部横切剖面呈圆锥形，果肉变褐腐烂，具苦味[2]。苹果炭疽病在世界上所有气候温暖湿润、适宜种植苹果的国家和地区都有发生，如美国、澳大利亚、英国、法国、德国、丹麦、保加利亚、荷兰、俄罗斯、巴西、墨西哥、日本、韩国等[3]。苹果果实炭疽病通常在果实近成熟时开始发病，采收后贮藏期间继续发展，造成采前大量落果和采后贮藏中发生果腐，病果率达30%左右，严重可达50%～60%，我国每年因炭疽病造成的果品采后损失为20%～30%，采后果实腐烂已是生产中的突出问题[4]。2013年笔者调查了甘肃省苹果主产区果实炭疽病的发病率，通常在0.8%～13.6%，属轻、中度发生。通过采样和室内分离鉴定，旨在明确病原菌的种类，为生产中科学制定防控策略提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1病样标本采集及病原菌分离 　　2013年9月从甘肃省陇南市礼县永平乡、永兴乡、祁山乡、天水麦积区伯阳镇、清水县永清镇等苹果主产区采集炭疽病标样，苹果品种为红元帅。病原菌的分离采用常规组织分离法，对采集的标样进行分离纯培养后，将菌种保存在试管斜面上。[JP] 　　1.2致病性测定 　　致病性测定参照张荣等的方法[5]。选择有代表性的菌株，将供试菌株移于PDA（potato dextrose agar）培养基斜面上培养，7 d后用无菌水洗下分生孢子，配置成分生孢子悬浮液，浓度为1×105 个/mL。取健康的红元帅苹果，用自来水清洗表面，70%乙醇表面消毒，自然风干，将捆扎在一起的5根7号昆虫针于乙醇灯上烧灼消毒，冷却后，扎刺果实，形成深度2.5 cm 的伤口，用移液枪向伤口中注入20 μL孢子悬浮液，25 ℃恒温箱内保湿培养。对照用无菌水接种。每处理设3个重复。观察病记录接种结果。对接种发病的病斑再次进行组织分离。 　　1.3病原菌形态鉴定 　　选取具有代表性的菌株移植于PDA 平板上，置于25 ℃的恒温培养箱中培养，观察病原菌在PDA平板上的菌落特征、培养性状，7～10 d后，挑取分生孢子团，进行镜检，观察分生孢子的形态特征，并用显微测微尺测量分生孢子大小。 　　1.4病原菌ITS序列?y定与分析 　　病原菌的DNA提取和核糖体rDNA的内部转录间隔区ITS区域的扩增与测序委托上海基康生物技术有限公司完成。 　　1.4.1DNA提取 　　病原菌DNA提取采用White等的方法[6]。[JP] 　　1.4.2核糖体rDNA ITS区域的扩增与测序 　　扩增所用引物为ITS区通用引物ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[7]。PCR反应体系总体积为25.0 μL：10×PCR 缓冲液2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板2.0 μL，超纯水14.3 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃复性30 s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。取 5 μL 反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪下检测PCR产物大小，DNA Marker DL 2000。用北京博大泰克生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒，扩增产物上样ABI3730DNA 测序仪检测，采用双脱氧测序法，测序引物为ITS1-F /ITS4，进行双向测序。 　　1.4.3病原菌rDNA ITS 序列分析 　　选择具有代表性的菌株，将所测得到菌株ITS的序列加入到NCBI（美国国家生物技术