生防细菌LN04抑菌谱检测及其抗菌蛋白部分特性剖析.docVIP

生防细菌LN04抑菌谱检测及其抗菌蛋白部分特性剖析 　　摘 要： LN04是一株分离自鳗鲡养殖场排污口附近的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其发酵上清液与淡水养殖主要病原菌进行拮抗试验，结果表明，LN04对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）、星状诺卡氏菌（Nocardia asteroides）和鳗弧菌 （Vibrio anguillarum）有很强的抑制作用。LN04的无菌发酵液经硫酸铵沉淀，沉淀物透析除盐后所得的活性物质粗提物初步鉴定为一种抗菌蛋白质，该抗菌蛋白可耐受100 ℃的高温，对酸的耐受性也比较强，但对部分蛋白酶敏感。LN04对部分淡水养殖病原菌的强抑菌作用和它的抗菌蛋白对环境条件的高稳定性，表明该菌有可能作为一种生防细菌，开发应用于淡水养殖中细菌病害的防治。 　　关键词：生防细菌；抑菌谱；抗菌蛋白 　　中图分类号：S432.4 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.004 　　细菌病是水产养殖过程中的常见病害，慢性或急性发作都会造成养殖生产的重大损失[1]。目前施用抗生素是细菌病防治的主要手段，但应用抗生素防治细菌病往往引发诸多严重问题，包括细菌耐药性、药残及对养殖环境和流域因抗生素本底残留而造成的污染等[2]。国内外诸多研究和生产实践表明，针对性地筛选病原菌的拮抗菌，通过以菌治菌，可有效寻找到解决细菌性疾病的新途径[3-7]。本研究从鳗鲡养殖场排污口附近分离到一些水产常见致病菌的拮抗菌，其中菌株LN04对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌、星状诺卡氏菌和鳗弧菌有很强的抑制作用，笔者开展了该菌株的抗菌谱检测试验并对其抗菌蛋白的部分特性进行了分析，以期为该生防菌株的开发应用提供科学依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 样品来源 　　用于分离目标菌株的样品采自福建福清市某一鳗鲡养殖场，该养殖场经常发生严重的鳗鲡细菌性病害。 　　1.2 拮抗菌的分离和富集 　　1.2.1 培养基 分离培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， 琼脂20 g，NaCl 10 g，水1 000 mL。 　　富集培养基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL。 　　1.2.2 拮抗菌的分离、富集 先以梯度稀释法对样品进行若干梯度的稀释，然后采用涂布平板法在装有分离培养基的平板上进行各梯度稀释液的涂布，置于生化培养箱中培养。24 h后，挑取单菌落至装有上述富集培养基的试管，置于台式摇床中进行发酵（37 ℃，180 r·mim-1 ），32 h后下摇床，通过离心或滤膜过滤的方法进行除菌，获得上清液，然后检测上清液是否有抑菌活性。 　　1.2.3 抑菌活性检测 抑菌活性的检测方法按照参考文献[8]进行，指示菌为鳗弧菌 （Vibrio anguillarum），该菌来自于国家海洋局第三海洋研究所微生物实验室。 　　1.2.4 拮抗菌的初步鉴定 应用菌株的形态学、生理生化试验以及菌株的16S rDNA测序比对，进行拮抗菌的初步鉴定，其中16S rDNA测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 　　1.3 菌种发酵和抑菌谱检测 　　1.3.1 菌种发酵 把筛选到的拮抗菌接种至装有KB液体培养基的三角瓶中（接种量5%）进行发酵培养（37 ℃，200 r·min-1），发酵持续48 h，然后发酵液离心（8 000 r·mim-1， 10 min， 4 ℃）去菌体，所得上清液于4 ℃保存备用。 　　1.3.2 抑菌谱测定 选择鳗鲡养殖主要常见致病菌，包括嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）、星状诺卡氏菌（Nocardia asteroides）、鳗弧菌 （Vibrio anguillarum）、荧光假单胞菌 （Pseudomonas fluorescens）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）等作为抗菌谱检测菌（这些检测菌除鳗弧菌外均来自于福建师范大学教育部工业微生物重点实验室），按1.2.3方法，进行目标菌发酵上清液对这些病原菌的抑菌作用检测，得出所选目标菌（拮抗菌）的抑菌谱。 　　1.4 抗菌物质类型的初步鉴定 　　根据预试验结果，把发酵液除菌后所得上清液用饱和度为70%的硫酸铵溶液沉淀，离心（10 000 r·mim-1， 10 min， 4 ℃）后得沉淀物和离心液，对沉淀物进行透析除盐，并进行浓缩，得到抗菌物质（即抗菌蛋白）粗提物，用无菌水复溶粗提物，以KB培养基为对照，用1.2.3的方法分别检测该粗提物、离心液及上清液