超声造影剂介导下增强腺病毒相关病毒心肌靶向转染率的实验研究-内科学(心血管)专业论文.docx

摘 摘 要 新疆医科大学医学博士学位论文 新疆医科大学医学博士学位论文 — — PAGE 3— — — PAGE 4— 超声造影剂介导下增强腺病毒相关病毒心肌 靶向转染率的实验研究 博士研究生：杨少玲 导师：穆玉明 教授 摘 要 目的：本研究旨在探讨超声造影剂介导下增强标记有 GFP 报告基因的腺相关病 毒载体（rAAV2-GFP）心肌内靶向转染的转染效率。本研究探讨经系统输入法，超 声介导下 rAAV2-GFP 心肌转染的重组腺相关病毒的最佳滴度；探讨超声造影剂介导 下增强 rAAV2-GFP 心肌靶向转染前后心功能的变化；探讨超声造影剂介导下 rAAV2-GFP 在心肌内的靶向转染效率。方法：将同种属同窝别同年龄雌雄不限 SD 大鼠，体重为 250～350 克，随机分为 7 组，每组 3 只，共 21 只。包括 6 个实验组 和 1 个对照组。根据 rAAV2-GFP 滴度不同将实验组分为以下 6 组：1 组滴度为 1.5×109vg/ml；2 组滴度为 3.0×109vg/ml；3 组滴度为 1.5×1010vg/ml；4 组滴度为 3.0×1010vg/ml；5 组滴度为 1.5×1011vg/ml；6 组滴度为 3.0×1011vg/ml。苯巴比妥钠 50mg/kg 腹腔麻醉。各实验组通过尾静脉注入携带上述不同滴度 rAAV2-GFP 的 SonoVue 微泡造影剂 1.2ml。对照组通过尾静脉注入 1.2ml 的 SonoVue。首先使用 GE Vivid 7 Dimension 超声诊断仪所配备的 i13L 线阵探头，探头频率为 10～14MHz，经 左胸壁进行心脏超声心动图检查。仪器设置为低机械指数 MI﹦0.4（mechanical index， MI）。当心肌组织内见微泡造影剂充盈时立即换成 M3S 探头，探头频率为 2.0～ 3.5MHz，启用二次谐波功能，发射频率为 1.3MHz，接收频率为 2.6MHz 并进入反向 编码实时心肌造影模式，使机械指数调至 1.02，利用 FLASH（fast low-angle shot， FLASH）功能破坏心腔及心肌组织中的造影剂微泡，并进行心电触发，每三到六个 心动周期触发一次，以达到定点爆破造影剂微泡的目的。每触发一次间隔 2～5 秒， 以利于下一心动周期有足够的超声造影剂进入心肌组织内。14 天后，麻药过量处死 大鼠。取心脏组织做冰冻切片，切片厚度为 5μm 以下。荧光显微镜下观察心肌内荧 光的表达量代表腺相关病毒载体的转染量；将同种属同窝别同年龄雌雄不限 SD 大 鼠，体重 250～350 克，随机分为 2 组，每组 10 只，共 20 只。采用苯巴比妥钠 50mg/kg 腹腔麻醉。对照组给予单纯尾静脉注射超声造影剂 SonoVue 并于体表心脏部位进行 超声照射破坏造影剂微泡（不携带 rAAV2-GFP）；实验组给予尾静脉注射携带有 rAAV2-GFP 的微泡造影剂 SonoVue 并于体表心脏部位进行超声照射。使用 i13L 线阵 变频探头，探头频率为 10～14MHz，仪器设置为低机械指数 MI＝0.4，行超声心动 图实时监测，当超声微泡进入心肌组织内时，立即换成 M3S 探头，参数设置同前， 爆破微泡至微泡完全消失，从而达到定点爆破造影剂微泡、定点释放 rAAV2-GFP、 促进腺相关病毒载体定点转染至心肌组织内的目的。分别于实验前及实验后 14 天由 同一名有经验的超声心动图医师完成心功能数据的采集。分别采集大鼠二尖瓣水平 短轴、乳头肌水平短轴及心尖短轴二维灰阶动态图（帧频为 92～123frames/s）各 3 个心动周期，保持心率一致，储存于 EchoPAC 工作站。使用 EchoPAC 工作站做后 处理分析。应用 2DS 分析软件，对每一动态图像分别于收缩末期手动勾画左室心内 膜边界，软件自动生成感兴趣区（ROI），调整 ROI 宽度使其包纳心肌全层。运行 程序后软件自动逐帧追踪 ROI 内心肌运动，并将室壁划分为 6 个节段，得出各节段 及左室整体的应变、应变率、旋转角度、扭转角度、达峰时间等参数：乳头肌水平 短轴切面测量左室周向应变（SC）、收缩期周向应变率（SrcSYS）、舒张早期周向 应变率（SrcE）舒张晚期周向应变率（SrcA）。二尖瓣水平短轴及心尖水平短轴测 量心底整体最大收缩期旋转角度（RotMV）、心尖整体最大收缩期旋转角度（RotAP）。 逆时针方向旋转角度定义为正值，顺时针方向旋转角度定义为负值。左室扭转角度 （LVtor）定义为：LVtor＝RotMV－RotAP。对不同大鼠间心率差异进行时间校标， 将主动脉瓣关闭时间点（AVC）设定为收缩期末，下一个心动周期的 R 波顶点设定 为舒张期末，测量扭转峰值角度、达