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粗品肝素中有害杂质的检测-生物化工专业论文
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华
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文
I
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摘 要
肝素是 Dag Mclean 在 1916 年研究凝血机制时发现的一种酸性粘多糖。它是一 种是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸 IdoA;D-葡萄糖醛酸 GlcA)和葡萄糖胺(α-D 葡萄 糖胺 GlcN)组成的具有不同链长的多糖链混合物。到目前为止,还没有能够完全代 替它的药品,仍是最重要的生化药物之一。肝素广泛分布在哺乳动物肝、肺、肠粘 膜、心、肾、脾、胎盘、胸腺、肌肉和血液等组织中。2008 年,从海外进入美国的 肝素原料药和最终成品中发现人为添加的多硫酸软骨素(over-sulfated chondroitin sulfate,OSCS)。随着有关肝素产品的有害报导的不断增加,通过 FDA、企业和研 究机构的协作研究证实某些病人的过敏反应与在肝素中存在 OSCS 有关。因此,OSCS 的检测成了肝素粗品质量控制重要指标之一。据国外文献报导 核 磁 共 振 氢 谱 (1H-nuclear magnetic resonance, 1H-NMR)从 OSCS 污染的肝素中可以检测到异于肝 素的 N-乙酰基甲基峰,通过检测这一特征峰可以判断肝素中是否含有 OSCS 污染物。 另外,国外的研究团队对强阴离子交换高效液相色谱(strong anion exchange-high performance liquid chromatography,SAX-HPLC)检测肝素中 OSCS 含量的方法进行 了相关的研究。由于牛海绵状脑病以及其他动物病毒疾病的存在,猪来源的唯一性 就成了确保肝素安全性的一条关键要求。本研究的主要工作如下:
1.1H-NMR 检测粗品肝素中 OSCS
调节 pH 除去粗品肝素中的蛋白质,以 80%乙醇等体积沉淀肝素对粗品肝素进 行了预处理;以 400MHz 、298K 和 64 次扫描的条件检测粗品肝素的 N-乙酰基甲基 信号。经过多次试验均未检测到待测样品中存在的 OSCS 的 N-乙酰基甲基峰信号, 而 DS(硫酸皮肤素)的 N-乙酰基甲基峰信号总是伴随着肝素的信号出现。因此判定 待检粗品肝素样品未受人为添加的 OSCS 的污染,并且含有大量的 DS。通过添加适 当的 OSCS 标准品至粗品肝素中,考察 1H-NMR 检测 OSCS 的检测限。当 OSCS 添 加量为 0.25%时信号响应微弱以至于难以与噪音分辨,所以确定该方法对 OSCS 的检 测限为 0.5%的添加量。
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2.SAX-HPLC 检测粗品肝素中 OSCS
参照美国 FDA 文献的方法,在粗品肝素中添加适量的 OSCS 美国药典标准品确 立 OSCS 的检测限。两种方法得到的结果与核磁共振的结果一致,添加 0.25%OSCS 美国药典标准品的粗品肝素中的 OSCS 特征峰很难辨别;因此,SAX-HPLC 检测粗 品肝素中 OSCS 的检测限为 0.5%的添加量。美国 FDA 文献建立的方法所耗费的时间 比中国药典 2010 年版要短,更具有实际采用的价值。
3.实时荧光定量 PCR 检测粗品肝素中的反刍基因
考察了 2 种引物和 2 种荧光定量 PCR 方法对于粗品肝素中反刍基因的扩增情 况。2 组引物均会引起猪 DNA 与反刍动物 DNA 产生交叉反应,该交叉反应对猪 DNA 和反刍 DNA 的鉴别不构成严重障碍。对猪、反刍的 DNA 检测限分别为 1.16pg/μl、 0.05 pg/μl 和 0.116 pg/μl、0.05 pg/μl。荧光探针体系中的交叉反应效果较轻,特异性 更好,对反刍动物 DNA 的检测限为 0.05 pg/μl。因此,在检测费用充裕的情况下, 采用荧光探针法检测粗品肝素中的反刍基因更准确。
关键词: 粗品肝素;多
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