虫草素抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化及其机制研究-肾脏病学专业论文.docx

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要 1 英文摘要 4 主要符号表8 前 言 9 材料与方法11 结 果 24 讨 论 42 结 论 46 参考文献 47 综 述 52 攻读硕士学位期间研究成果61 致 谢 62 原创性及知识产权声明 63 中文摘要 虫草素抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化及其机制研究 研究背景及目的 学科专业：肾脏病学 硕士研究生：梁泽智 导 师：祝胜郎 教授 中文摘要 广州 广州医科中文摘要大学硕士学位论文 糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是导致糖 尿病患者死亡的常见原因，也是终末期肾病（ESRD）的主要原因之一。糖尿病肾病严重影响糖 尿病患者的存活率及生存质量。肾小管上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal-transition， EMT）是糖尿病肾病肾间质纤维化发生的关键环节；细胞外基质（Extracellular matrix，ECM） 过量堆积是 DN 发生的重要机制，肾小球硬化及肾间质的纤维化是 DN 终末期的共同的病理改变。 丝裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联是细胞内主要 的信号转导系统。细胞运用这一系统将细胞外信号传递到细胞核，介导细胞产生反应。丝裂原 激活的蛋白激酶 38（p38MAPK）是 MAPK 家族的一个亚族，p38MAPK 信号通路可被多种刺激因素 激活, 包括高糖、炎症因子、活性氧等，激活后可通过上调 TGF-β/Smad 等多条信号转导途径， 最终导致系膜基质成分如 ColⅣ，FN，LN 增多。有研究显示：高糖和牵张刺激可活化系膜细胞 的 p38MAPK，并诱导 TGFβ1 和纤维连接蛋白的表达，提示 p38MAPK 信号通路可能参与了糖尿 病肾纤维化的发病过程。 虫草素（Cordycepin）是从冬虫夏草中分离出来的单体，是一种核苷类似物，在结构上的 类似于腺苷。研究证实虫草素可干扰一系列生化及分子过程，包括嘌呤合成，凋亡，引起细胞 周期阻滞和抗肿瘤转移。目前一些研究提示虫草素对肾脏疾病具有治疗作用：它可以通过抑制 HGF 表达从而抑制肾间质肌成纤维细胞激活最终抑制肾纤维化；抑制 ROS 产生而保护白蛋白对 肾小管上皮细胞的损伤；抑制 TGF-β 引起的肾小管上皮纤维化改变并保护 UUO 小鼠的肾损伤。 然而，虫草素治疗糖尿病肾病的确切机制未有报道，仍有待研究。 本研究通过体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E），用高糖及虫草素干预后，检测 相关指标：通过检测上皮细胞表型的标志蛋白 E-Cadherin，肌成纤维细胞表型的标志蛋白α -SMA 以及纤维化的标志蛋白 TGF-β1，了解高糖及虫草素对 NRK-52E 细胞中上皮细胞间充质转 分化的影响；通过检测Ⅰ型胶原蛋白，Ⅳ型胶原蛋白，纤维连接蛋白，结缔组织生长因子等细 11 1 广州医科大学硕士学位论文 胞外基质主要成分，了解高糖及虫草素对细胞外基质的生成的影响；通过检测 p38MAPK mRNA 和蛋白的表达，了解高糖及虫草素对 NRK-52E 细胞中 p38MAPK 信号通路的影响。通过本实验， 旨在进一步认识高糖在促进糖尿病肾病的分子机制，了解虫草素治疗糖尿病肾病的可能作用机 制，为临床治疗糖尿病肾病提供新的思路。 方法 体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E 细胞株），分为正常对照组（葡萄糖 5.5mmol/L，NG 组）、高糖组（葡萄糖 30mmol/L，HG 组）、高糖+虫草素组（葡萄糖 30mmol/L + 虫草素 10?g/ml，HG+C 组）。分别于刺激 15min，30min，60min，12H，24H，48H 后收集细胞。 应用定量 RT-PCR 测定 p38MAPK，TGF-β1，E-cadherin，α-SMA，CollagenⅠ，CollagenⅣ ， CTGF，FN mRNA 的表达；Western 印迹方法检测其蛋白的表达。 结果 1. 高糖刺激后 NRK52E 细胞的 TGF-β 和α-SMA mRNA 及蛋白表达明显高于正常糖组（P＜ 0.05），而虫草素组 TGF-β 和α-SMA mRNA 及蛋白表达显著低于高糖组（P＜0.05）；高糖诱导 的 NRK52E 细胞 E-cadherin mRNA 及蛋白水平明显降低（P＜0.05）；而虫草素组 NRK52E 细胞 E-cadherin mRNA 及蛋白水平显著高于高糖组（P＜0.05）。 2.高糖刺激后 NRK52E 细胞的 CollagenⅠ，CollagenⅣ ，CTGF 和 FN mRNA 及蛋白表达明 显高于正常糖组（